DNA是遺傳信息的主要載體，是生命奧秘的根本。而DNA合成則是人類探索生命奧秘過程中的必要工具。傳統(tǒng)的柱式DNA合成技術(shù)能夠適應(yīng)一些小規(guī)模的科研場景。但如果深入到基因組層面，即使是最小的病毒基因組，也有幾十Kb的長度，常見模式微生物大腸桿菌的基因組更有約4.2Mb的大小。如果使用傳統(tǒng)的柱式DNA合成法來制備，這些最簡單的基因組的制備成本就動輒數(shù)百萬元。

應(yīng)對于更復(fù)雜的DNA合成需求，高通量原位DNA合成技術(shù)逐漸進入人們的視野。DNA合成技術(shù)的高通量化正如電子計算機當年經(jīng)歷的小型化過程。如果沒有光刻機和大規(guī)模集成電路制造技術(shù)，電子計算機可能今天仍然深藏于象牙塔中，無法在各領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

那么，能夠推動生命奧秘探索的“高通量原位DNA合成技術(shù)”究竟是怎樣的呢？這一產(chǎn)業(yè)又將如何實現(xiàn)國產(chǎn)化？本文梳理了DNA合成技術(shù)的發(fā)展過程，并對產(chǎn)業(yè)的未來發(fā)展進行了預(yù)判。

DNA的生物合成和化學合成

生物體內(nèi)的DNA合成是通過DNA聚合酶進行的，DNA聚合酶可以合成與模板鏈完全互補的DNA鏈。DNA生物合成的優(yōu)點是速度快、條件溫和、錯誤率低，人們利用這個原理發(fā)展了PCR技術(shù)，可以快速廉價的得到DNA鏈。但DNA生物合成依賴模板鏈，只能從已有的生物基因組中獲取模板，合成互補的DNA鏈，卻無法在沒有模板的情況下，從頭合成全新的DNA鏈，因此不能滿足合成生物學和DNA存儲的需求。

化學合成法曾在很長一段時間中成為直接合成DNA的主要方法。DNA化學合成基于固相化學合成的原理。固相化學合成的思路最早應(yīng)用于多肽合成，性能突出，后續(xù)也廣泛用于核苷酸和多糖的合成。發(fā)明人Merryfield因這一技術(shù)獲得了1984年諾貝爾獎。

DNA化學合成由多個反應(yīng)循環(huán)組成，單個循環(huán)主要包括脫保護、偶聯(lián)、加帽、氧化四個步驟，循環(huán)地將合成載體上被保護的DNA鏈末端脫去保護，連接一個新的被保護的核苷酸單體，DNA鏈長加一。合成過程中多余的原料和雜質(zhì)留在溶液中，而產(chǎn)物則保留在固相的載體上，因而不需要每步反應(yīng)都進行純化，特別適合長鏈生物大分子的自動化合成。DNA化學合成不需要模板，可以按需合成DNA鏈，但由于有機合成反應(yīng)并不完全，如每循環(huán)合成效率為99%，則合成長度為100的DNA鏈，最終產(chǎn)物的得率只有0.99^100，即36.6%，因此DNA化學合成得到的鏈長往往小于生物合成。

圖1：DNA固相化學合成（亞磷酰胺法）原理（圖片源自網(wǎng)絡(luò)）

利用DNA固相化學合成技術(shù)，可以在每個反應(yīng)器上合成一條DNA，但由于化學合成的效率沒有生物合成那么高，得到的DNA鏈長度通常不能超過200堿基。目前業(yè)界基于固相合成原理的柱式DNA合成儀（圖2），通過柱式反應(yīng)器進行DNA合成，借助工業(yè)自動化技術(shù)，可以同時控制192或者最多1536個反應(yīng)器進行同時合成，即192或者最多1536條DNA鏈的合成通量。但限于反應(yīng)器的尺寸，合成通量實際上已經(jīng)達到了極限。如果僅用這個技術(shù)來進行大基因組合成，仍然如同步行環(huán)游世界一樣困難重重。因此，DNA固相化學合成與合成基因組之間巨大的技術(shù)鴻溝，還需要用巧妙的方法來填平。

高通量的“控制開關(guān)”

半導體行業(yè)中曾經(jīng)遇到過類似的瓶頸。1938年人們發(fā)明了晶體管，并在1950年前后掌握了PN結(jié)的工作原理。一個晶體管就如同一條化學合成的DNA短鏈，不能發(fā)揮很大的作用，而利用光刻機、掩模板和光刻膠，人們可以在硅片的不同區(qū)域刻畫出不同的圖形，使得一些區(qū)域被暴露參加化學反應(yīng)，另一些區(qū)域被光刻膠等保護起來不參加化學反應(yīng)，通過這樣的高通量“控制開關(guān)”，就可以在硅片的不同區(qū)域分別加工出微小的PN結(jié)、導線、電阻、電容等，最終制造出功能強大的CPU等芯片。信息產(chǎn)業(yè)摩爾定律式的飛速發(fā)展，證明了高密度集成芯片能極大降低電路成本和極大提高集成度。光刻機和芯片對信息產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到了飛躍性的提升效果。

因此，基于同樣的思路，只要把大量的DNA化學合成位點集中在一個表面上，再設(shè)計合適的開關(guān)機制，自動控制表面上成千上萬個合成位點的打開和關(guān)閉，使得反應(yīng)按需地在特定區(qū)域進行，就可以制造出真正意義上的高通量DNA合成芯片。高通量DNA合成芯片在芯片大小的表面上可以同時進行數(shù)以萬計甚至更多的DNA合成，合成成本比常規(guī)合成降低了幾個數(shù)量級。盡管得到的每種DNA產(chǎn)物也比常規(guī)合成也降低了幾個數(shù)量級，但在獲得初始產(chǎn)物后，接下來就可以利用廉價高效的PCR技術(shù)對初始產(chǎn)物進行大量復(fù)制，大幅降低擴增成本。因此利用高通量DNA合成技術(shù)，實際可以把DNA從頭合成的成本降低幾個數(shù)量級。

而高通量DNA合成技術(shù)和裝備使得低成本的合成生物學、DNA存儲等變得可行，使得深刻認識、改造生物體成為可能。實際上，因為高通量DNA合成裝備的這一重要性，目前在市場上幾乎只能采購DNA合成服務(wù)，而高通量DNA合成設(shè)備卻無法購買。

高通量DNA合成的技術(shù)路線

高通量DNA合成儀器目前較為成熟的技術(shù)路線主要有三種：光化學法、電化學法、微液滴法。

光化學法是美國Affymetrix公司（現(xiàn)已被Thermo Fisher公司收購）最早應(yīng)用，以光做為反應(yīng)開關(guān)。利用多組光掩模遮擋紫外光，使得芯片不同局部在不同時間經(jīng)光催化產(chǎn)酸，脫去DNA單體的保護基，從而連接上不同的DNA單體。但光催化反應(yīng)效率稍差，難以獲得很長的DNA鏈，除固相雜交基因芯片外，目前應(yīng)用較少。

圖3 光化學方法高通量DNA合成（圖片源自網(wǎng)絡(luò)）

電化學法是美國CustomArray公司（現(xiàn)已被GenScript金斯瑞公司收購）最早應(yīng)用，以電流為反應(yīng)開關(guān)。其芯片上集成了高密度的電極陣列，每個電極可以獨立控制，電極通電時可產(chǎn)酸，脫去DNA單體的保護基，連接DNA單體。該方法合成DNA質(zhì)量優(yōu)于光化學法，但合成時芯片全部浸泡在反應(yīng)液中，局部產(chǎn)生的酸仍有可能因為擴散而影響相鄰區(qū)域，實際效率不如微液滴法。

圖4 電化學法高通量DNA合成（圖片源自網(wǎng)絡(luò)）

微液滴法使用特殊設(shè)計的微液滴發(fā)生裝置在芯片上產(chǎn)生微小液滴，通過空間隔離方式來控制反應(yīng)，目前美國Agilent公司和Twist公司通過定制的噴墨打印裝置實現(xiàn)了這一方法。每個反應(yīng)位點可以按需在不同的時間點提供反應(yīng)液的微液滴，故而每個反應(yīng)位點之間都是物理隔離的，不存在交叉污染的可能性。因此這種高通量合成方法制備的DNA質(zhì)量最好，目前應(yīng)用最為廣泛。但是精確獨立控制大量微液滴內(nèi)的合成反應(yīng)，對芯片制造、微液滴、控制與反饋、軟件系統(tǒng)等都提出了很高的需求，其研發(fā)需要橫跨多個專業(yè)領(lǐng)域，技術(shù)壁壘也最高。

圖5 微液滴法高通量DNA合成（圖片源自網(wǎng)絡(luò)）

全球資本市場對于微液滴法高通量DNA合成設(shè)備表現(xiàn)出了很高的期待。2018年10月Twist上市時，發(fā)行價才只有每股14美元，在至今不到3年的時間內(nèi)，Twist的股價最高曾到達過214.07美元的高峰，企業(yè)市值達到百億美元級別。國內(nèi)也有多家NGS企業(yè)與Twist達成了合作，雖然這些合作分布于不同的具體場景中，但是達成這些合作的基礎(chǔ)，都在于Twist領(lǐng)先的高通量原位DNA合成技術(shù)。

目前，基于前述三種原理之外的高通量合成設(shè)備，市面上尚未出現(xiàn)，但在科研階段還有一些有意義的探索。有學者利用DNA連接酶實現(xiàn)了酶促的無模板DNA合成，其原理本質(zhì)是將酶和核苷酸連接，構(gòu)造出可以酶促DNA合成的特殊單體，可看作是固相合成的一種變形。該方法目前僅停留在實驗室水平，成本甚至遠高于傳統(tǒng)柱式合成，而柱式合成比高通量合成的成本高出幾個數(shù)量級，暫時看不到其應(yīng)用于高通量合成的商業(yè)可行性。

另一種可能性是使用組合化學進行高通量DNA合成。其原理是每循環(huán)將DNA合成載體分成4份，分別放入4種亞磷酰胺單體中連接不同單體后，再把載體重新混合起來。根據(jù)排列組合，n個循環(huán)得到的產(chǎn)物共有4^n種。這種方法原理和控制簡單，但冗余的產(chǎn)物太多，絕大多數(shù)的產(chǎn)物是無用序列，需要配合一系列方法從中篩選少量有用產(chǎn)物。

高通量DNA合成設(shè)備的國產(chǎn)化進程

近年來，國內(nèi)生命健康領(lǐng)域發(fā)展迅速。高通量測序在疾病篩查、農(nóng)作物檢測、法醫(yī)鑒定等場景的應(yīng)用已經(jīng)普遍開展，并且呈現(xiàn)出向上的發(fā)展勢頭。可是，這些應(yīng)用源頭的檢測試劑中使用的DNA探針，仍然基本依賴于國外進口，國內(nèi)廠商僅能開發(fā)傳統(tǒng)柱式DNA合成儀，其由于前述的成本在數(shù)量級上劣勢，僅能應(yīng)用于低端的DNA引物市場。

杭州原合生物是首家獨立掌握研發(fā)微液滴法高通量DNA合成儀器技術(shù)的國內(nèi)廠商。創(chuàng)始人蔡萬世博士曾研發(fā)出探針雜交、多重PCR兩套獨立自主知識產(chǎn)權(quán)的基因捕獲技術(shù)，深刻體會高通量DNA合成技術(shù)對于基因行業(yè)的必要性；創(chuàng)始人鄭暉博士具備多學科綜合背景，曾成功研發(fā)包括固相化學合成微流控芯片和自動化合成儀在內(nèi)的多種儀器，是國內(nèi)為數(shù)不多具備高通量合成裝備相關(guān)經(jīng)驗的專業(yè)人士之一。

研發(fā)團隊迎難而上，歷經(jīng)數(shù)年艱苦攻關(guān)，突破了合成工藝、控制系統(tǒng)、芯片加工修飾等多重難題，采用微液滴方法在芯片上成功地原位合成DNA。目前首款合成芯片已經(jīng)可以一次性合成6200條DNA，合成密度可以達到每平方毫米150條DNA以上，合成DNA長度>80nt，均一性好，單條DNA產(chǎn)量約0.5fmol，合成錯誤率小于1%。儀器性能已經(jīng)可以初步滿足基因測序、基因合成等高通量DNA的主要應(yīng)用場景。預(yù)計在年內(nèi)，即可達到合成通量在10萬條以上，合成長度>150nt的技術(shù)水平，從而實現(xiàn)國產(chǎn)高通量DNA合成設(shè)備的技術(shù)突破。

圖6 杭州原合生物高通量DNA合成芯片的產(chǎn)物均一性測序結(jié)果

國產(chǎn)高通量DNA合成設(shè)備的應(yīng)用生態(tài)

國產(chǎn)高通量DNA合成設(shè)備能夠極大降低DNA的合成成本，有望提高國內(nèi)生物產(chǎn)業(yè)的競爭力。目前國內(nèi)的高通量DNA合成應(yīng)用已經(jīng)非常繁榮，相關(guān)領(lǐng)域的前景逐漸明朗。健全的應(yīng)用生態(tài)將進一步促進這一技術(shù)裝備不斷迭代，縮小與最先進設(shè)備的差距。

一方面，高通量DNA合成正在推動現(xiàn)有技術(shù)升級。

高通量合成助力寡核苷酸池相關(guān)應(yīng)用

寡核苷酸池（oligo pool）被廣泛用作各種探針庫。例如，遺傳病篩查服務(wù)中經(jīng)常使用雜交探針捕獲興趣片段用以測序。為了達到整個人外顯子組的覆蓋，通常需要合成百萬條目的oligo探針。如此規(guī)模的探針庫，以高通量合成的方式來構(gòu)建顯得十分合適。另外，針對某些興趣區(qū)域而特別訂制探針庫也將變得更為容易。這似乎為定制化的測序篩查服務(wù)提供了方便。

除此之外，寡核苷酸池也常用于各種功能篩選庫的構(gòu)建，如靶向定制基因集的CRISPR gRNA文庫，用于功能篩選的基因突變體文庫，抗體庫等。隨著高通量合成的普及，這些手段或?qū)⒊蔀轵炞C和發(fā)掘生物功能的“常規(guī)手段”。

以極低成本合成基因，助力合成生物學行業(yè)發(fā)展

由于化學合成正確率的限制，長鏈的基因通常是由小片段的寡核苷酸鏈拼接而成。高通量的oligo合成，間接帶來了合成大量基因甚至基因組的能力。因此，合成生物學（synthetic biology）相關(guān)領(lǐng)域無疑將收益頗深。

近年來，得益于DNA讀寫相關(guān)技術(shù)基礎(chǔ)的日益成熟，以及當前時代社會對新生產(chǎn)方式的期待，生命科學研究開始從被動解析向主動創(chuàng)造轉(zhuǎn)變。從格物致知到建物致知，同時知以致用，將基礎(chǔ)研究積累的基因功能知識與工程思想結(jié)合，通過構(gòu)造生物系統(tǒng)的方式，解決醫(yī)藥、化工、食品、能源、材料、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中的實際生產(chǎn)問題。合成生物學被普遍認為是下一次生物技術(shù)浪潮的焦點，有望觸發(fā)未來徹底的產(chǎn)業(yè)變革。

目前，國外已有大量合成生物學相關(guān)公司相繼成立，并出現(xiàn)完整的產(chǎn)業(yè)鏈條。上游提供基因合成，中間平臺提供生物系統(tǒng)設(shè)計和構(gòu)建方案，下游完成具體的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。國內(nèi)行業(yè)內(nèi)也已經(jīng)顯現(xiàn)出相似的趨勢。相信國產(chǎn)高通量合成技術(shù)的出現(xiàn)，也有利于合成生物學相關(guān)產(chǎn)業(yè)的振興。

另一方面，高通量DNA合成也在孕育新興應(yīng)用場景。

除了現(xiàn)有技術(shù)的升級，DNA合成能力的飛躍有可能“破圈”，實現(xiàn)生物行業(yè)以外的應(yīng)用。比如，DNA天然可以作為4進制的存儲介質(zhì)（A/T/C/G)，并擁有信息密度高，存儲時間長等優(yōu)勢。在數(shù)據(jù)量爆炸的世界，如果能進一步大幅壓縮每堿基的合成價格，DNA存儲也將不失為一種很好的信息存儲方式。

我國已經(jīng)是一個制造大國，但要成為制造強國，還必需在一些尖端制造裝備技術(shù)上實現(xiàn)突破。高通量DNA合成裝備集合了科學儀器、化學制劑等領(lǐng)域多項關(guān)鍵核心技術(shù)，關(guān)系到生物行業(yè)一系列下游技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展，其重要性不言而喻。杭州原合生物預(yù)期在7月份舉行交流發(fā)布會，屆時將進一步介紹其研發(fā)DNA高通量合成裝備和數(shù)據(jù)。作為服務(wù)方，杭州原合生物將與廣大科研院校和生物產(chǎn)業(yè)的同仁一起，為構(gòu)建自主自強的民族產(chǎn)業(yè)鏈不懈努力。

在7月份舉行交流發(fā)布會，屆時將進一步介紹其研發(fā)DNA高通量合成裝備和數(shù)據(jù)。作為服務(wù)方，杭州原合生物將與廣大科研院校和生物產(chǎn)業(yè)的同仁一起，為構(gòu)建自主自強的民族產(chǎn)業(yè)鏈不懈努力。