CAR-T療法已成為癌癥免疫治療的重要支柱之一。自2017年美國FDA批準全球首款CAR-T療法上市以來，已有4款CD19 CAR-T產品和1款BCMA CAR-T產品獲批，累計適應證包括急性淋巴細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤、原發縱隔B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤和多發性骨髓瘤。

不過，盡管CAR-T療法為血癌治療帶來了革命性的突破，但大量接受CD19或CD22單靶向CAR-T細胞療法（monoCAR-T cell therapy）治療的白血病和淋巴瘤患者會由于抗原丟失或下調而病情復發。

為了解決腫瘤抗原逃逸，克服這種耐藥性，很多科學家團隊開始嘗試開發同時靶向多個腫瘤抗原的多特性CAR-T細胞療法。其中，雙靶點CAR-T的開發在近幾年已經取得了不錯的進展。例如，去年在復發B細胞惡性腫瘤患者中調查CD19xCD20 CAR-T細胞療法的首個I期試驗結果顯示，所有12例接受高劑量、新鮮生產的雙特異性CAR-T細胞治療的患者全部有響應（第28天ORR為100%，CRR達92%）[1]。此外，多款CD19xCD22 CAR-T療法的臨床數據顯示，這類雙靶點CAR-T總體來說安全性比單靶點要好，ORR在70%-100%之間。

來源：Blood

在雙靶點CAR-T細胞療法取得積極成果的同時，一些研究者也在開發同時靶向三種腫瘤抗原的CAR-T細胞療法。該領域較早的一篇文獻于2017年發表在Blood雜志上[2]。來自貝勒醫學院的一個研究團隊報道了同時靶向CD19、CD20 以及CD22的三特異性CAR-T療法。

在該研究中，科學家們設計了兩種三特異性CAR-T細胞產品。一種是使T細胞表面分別表達三個獨立的CAR（TriCAR），這些CAR的胞外域分別來自靶向CD19、CD20和CD22的單鏈可變片段(ScFv)；另一種產品使T細胞表達一個靶向CD19的CAR，以及一個靶向CD20和CD22的雙特異性CAR(SideCAR)。所有CAR都與胞內信號域——共刺激分子4-1BB以及T細胞受體ζ鏈融合（屬于二代CAR）。

利用CD19逃逸模型（CD19陰性復發骨髓樣本以及用CRISPR敲除CD19的原發性ALL樣本），研究測試了TriCAR和SideCAR-T的有效性，結果顯示，三價CAR-T細胞有效降低了CD19陰性復發，可生產IFN-γ和TNF-α，殺死CD19陰性原發性ALL，相比之下，CD19單靶向CAR-T細胞對這些模型無效。

研究者們認為，這些結果表明，三價CAR-T細胞可以有效靶向具有不同抗原譜的原代ALL細胞，并緩解CD19陰性復發。該策略有潛力作為CD19陰性疾病復發患者的挽救性治療，以及原發性ALL的前線治療。

來源：Science Translational Medicine

3月24日，發表在Science Translational Medicine雜志上的一項研究中，來自Miltenyi Biotec子公司Lentigen的一個科學家團隊報道了三特異性CAR-T療法研發方面的一項最新進展[3]。該研究證實，同時靶向CD19、CD20和CD22的三特異性duoCAR-T細胞療法在體外能夠有效殺死抗原異質性腫瘤細胞混合物。此外，在小鼠模型中，三特異性duoCAR-T細胞療法也成功控制了抗原異質性腫瘤的負擔。

具體來說，在該研究中，為了克服B細胞腫瘤抗原逃逸，科學家們利用編碼兩種CAR開放閱讀框的慢病毒載體設計了三特異性duoCAR-T細胞。duoCARs由一種“串聯CD19 binder (scFv)和CD20 binder(scFv)的CAR通過P2A自裂解肽連接到另一種靶向CD22的CAR上組成。研究評估了多種細胞內T細胞信號傳導基序組合，最有效的duoCAR結構包含ICOS、OX40或CD27共刺激域，而不是CD28或4-1BB。

DuoCARs D1、D2、 D3和D4的設計、表達和特征（來源：Science Translational Medicine）

在確定4種最佳的binder和信號域組合后（如上圖A：D1、D2、 D3和D4），研究者們開始評估duoCAR-T細胞的功能。抗原陽性細胞系Raji淋巴瘤(CD19+CD20+CD22+)和REH B-ALL (CD19+CD20?CD22+)被用來測試duoCAR-T細胞以抗原特異性方式溶解腫瘤細胞的能力。結果顯示，duoCAR-T細胞與單CAR-T細胞一樣，以劑量依賴的方式裂解靶點陽性（target-positive）腫瘤細胞系。

接著，研究者們繼續調查duoCAR-T細胞在體內的療效。他們在Raji非霍奇金淋巴瘤(NHL)異種移植模型和NALM-6急性淋巴細胞白血病（ALL）模型測試了DuoCARs，這兩種腫瘤細胞均是CD19+CD20+CD22+三陽性，腫瘤細胞和CAR-T細胞都是通過尾靜脈注射。結果顯示，DuoCAR-T細胞可在體內清除彌漫性CD19+CD20+CD22+Raji和NALM-6腫瘤。

DuoCAR-T細胞在淋巴瘤和白血病的異種移植模型中根除了B細胞腫瘤（來源：Science Translational Medicine）

在證明duoCARs能夠在體內介導CD19+CD20+CD22+NALM-6和Raji腫瘤的排斥反應后，研究人員繼續調查了是否單個抗原也能觸發duoCAR-T細胞的激活。他們將過表達CD19、CD20或CD22其中一種抗原的A431腫瘤細胞系克隆，以及基因敲除了CD19、CD20 或 CD22后只表達其它兩種抗原的Raji克隆，與 duoCAR-T共培養。結果證實，表達最優duoCAR的原代人類T細胞在面對只表達CD19、CD20 或 CD22其中一種抗原的細胞，和三種抗原中其中一種為陰性（CD19陰性、CD20陰性或CD22陰性）的淋巴瘤細胞系中，均顯示出了強大的抗腫瘤反應。

知識卡：CD19、CD20和CD22均為B細胞抗原。A431鱗狀細胞癌細胞系天然缺乏B細胞表面分子的表達。該研究通過基因工程手段，使A431細胞系穩定表達CD19、CD20或CD22其中一種抗原。表達CD19單抗原的A431細胞克隆被定義為A19，表達CD20單抗原的A431細胞克隆被定義為A20，表達CD22單抗原的A431細胞克隆被定義為A22。結果顯示，所有四種duoCAR-T細胞都能有效裂解A19、A20和A22靶細胞。

此外，為了檢測duoCAR-T細胞對抗原丟失型腫瘤細胞的抗腫瘤功能，科學家們將Raji19KO細胞（敲除CD19的Raji細胞）、Raji20KO細胞、Raji22KO細胞和親代Raji細胞(各占25%)的混合物植入NSG小鼠。這種Raji細胞克隆代表了一種靶點異質性（target-heterogeneous）腫瘤，在這類腫瘤中，一些腫瘤細胞會失去了某個靶抗原的表達，從而阻止了相應的CAR-T細胞的激活。在研究的第14天，研究者們發現所有的duoCAR-T細胞都能有效排斥異質性Raji腫瘤，且在研究結束時duoCAR-T細胞治療依然使小鼠維持在緩解狀態。相比之下，單靶向CAR（monoCAR）-T細胞都未能阻止腫瘤進展。

在抗原異質性的Raji腫瘤模型中，duoCARs的體內抗腫瘤活性和持久性（來源：Science Translational Medicine）

總結來說，這些結果表明，對于B細胞惡性腫瘤患者來說，多特異性duoCAR-T細胞可能是防止抗原丟失介導復發或靶抗原下調的一種非常有前途的策略。此外，研究也表明，三特異性靶向策略有望解決治療抗原異質性癌癥所面臨的挑戰。

專 家 點 評

優卡迪 CEO 俞磊博士

• 突破之處與潛在挑戰

發表在Science Translational Medicine上的這項新成果報道了一款三特異性CAR-T療法，該產品可以同時靶向CD19、CD20和CD22，且在臨床前研究中表現出極好的抗腫瘤活性。文章所介紹的具有識別三個不同抗原的三靶-CAR設計是在已有雙靶-CAR基礎上進一步的拓展，其優勢在于可以同時應答三種不同的細胞表面抗原，具有潛在克服因腫瘤異質性或抗原逃逸而造成的“復發”的幾率。但這種設計也存在潛在的挑戰性，包括1）三個scFv靶向分子的空間結構的互相干擾，和2）同一個產品“脫靶”幾率的增加，造成增加了因“脫靶”而出現的臨床副作用發生率的增加和嚴重性不確定性。

該研究小組同時對比使用了多款CAR載體分子，包括Single CAR、Tandem CAR、duoCAR，還進行了不同共刺激域組合研究，用到的共刺激域分子有4-1BB、ICOS、OX40、CD27、CD28。對比后發現，最有效的CAR結構包含ICOS、OX40或CD27信號結構域，而不是CD28或4-1BB信號結構域。最終該研究小組確定了四種最佳duoCAR元件組合，對于負荷抗原異質性淋巴瘤細胞的小鼠，duoCAR-T細胞表現出良好的抗腫瘤活性。該項研究為如何來克服腫瘤抗原丟失引起的CAR-T治療后短期復發問題展現了一個潛在的新解決思路，但從另一個角度看，這樣的設計也帶來了一定的局限性：三個以上靶分子（scFv）-CAR分子的基因轉導、表達和保持多靶分子的靶向功能的挑戰性與腫瘤異質性的多樣性的矛盾。

• 三靶點CAR-T仍需驗證

總體來說，三特異性CAR-T療法無疑是在雙靶-CAR-T的基礎上進一步通過增加抗腫瘤抗原的靶向分子而增加了抗復發的保險。三靶向-CAR技術理論上來說可以對抗早期復發的臨床問題，但目前該技術還處于臨床前研發階段，后續還有大量的工作需要去做，以進一步檢驗該技術的成藥性，比如臨床前毒性研究、產品開發工藝和質量標準研究、適應人群確定、給藥劑量、給藥時間等。

• 雙靶點CAR-T數據積極

CD19或CD22靶向CAR-T療法雖然可以有效改善B細胞白血病和淋巴瘤的治療效果，但 CAR-T治療后的短期復發問題仍是制約CAR-T技術發展的因素之一。斯隆·凱特琳紀念癌癥中心（MSKCC）隨訪數據顯示，多達50%的CAR19 T細胞治療患者在治療后第一年內復發，其中相當一部分表現出CD19抗原丟失。因此，單一靶點的細胞治療模式可能會喪失治療優勢，而多靶點的CAR-T細胞治療模式會是未來的發展趨勢。

相較于剛剛起步的三特性CAR-T，業界在開發雙靶點CAR-T療法方面已經做了很多努力，且獲得了一些積極進展。舉例來說，在2020 ESMO大會上，Autolus Therapeutics公司公布了其靶向CD19/CD22的雙靶點CAR-T療法AUTO3的臨床數據，中位隨訪6個月時，93%完全緩解的患者仍未出現復發。

早在2016年優卡迪就開始布局多靶點CAR-T產品，我們圍繞雙靶點CAR-T技術主要做了血液瘤和實體瘤兩個方向的布局。在血液瘤方向，我們已建立包含CD19/CD20、CD19/CD22、CD19/CD30等多款雙靶點產品在內的研發管線，這些產品目前均已經處于臨床試驗階段，此外，管線還包含雙靶與PDL1 Blocking技術聯合的三靶向產品。在實體瘤方面，考慮到實體腫瘤抗原異質性較高，我們認為更需要通過雙靶CAR設計來解決抗原異質性和抗原丟失的問題，比如HER2和MUC1雙靶點聯合治療乳腺癌，HER2和IL-13Rα2雙靶點聯合治療膠質瘤。

• CAR-T未來突破方向

展望未來幾年，我認為， CAR-T領域需要從解決臨床需求出發，在以下幾個方面進行突破：1）首先是安全性，一方面需要通過對靶抗原精準性和可控性的提高，減少“脫靶”，另一方面，也要開發出針對嚴重CRS和ICAN的預防策略；2）第二是治療后復發問題的改善，可通過多靶策略，深度清除腫瘤細胞，此外，也要想辦法提高CAR-T細胞在體內的持久性等；3）第三是新型通用型CAR-T的技術和產品開發，努力降低基因編輯在技術層面的“脫靶”幾率，獲得真正達到能和自體CAR-T具有相似有效性、安全性和持續性的“通用型CAR-T”產品；4）第四是攻克實體瘤，由于腫瘤的多樣性和腫瘤微環境的復雜性，聯合治療模式的開發也是未來需要突破的方向，如溶瘤病毒與CAR-T療法結合，PD-1/CTLA-4抗體與CAR-T療法結合和CAR-療法與其它免疫細胞療法的結合，如CAR-NK、CAR-M等。