CAR-T療法已成為癌癥免疫治療的重要支柱之一。自2017年美國(guó)FDA批準(zhǔn)全球首款CAR-T療法上市以來(lái)，已有4款CD19 CAR-T產(chǎn)品和1款BCMA CAR-T產(chǎn)品獲批，累計(jì)適應(yīng)證包括急性淋巴細(xì)胞白血病、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)縱隔B細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。

不過(guò)，盡管CAR-T療法為血癌治療帶來(lái)了革命性的突破，但大量接受CD19或CD22單靶向CAR-T細(xì)胞療法（monoCAR-T cell therapy）治療的白血病和淋巴瘤患者會(huì)由于抗原丟失或下調(diào)而病情復(fù)發(fā)。

為了解決腫瘤抗原逃逸，克服這種耐藥性，很多科學(xué)家團(tuán)隊(duì)開(kāi)始嘗試開(kāi)發(fā)同時(shí)靶向多個(gè)腫瘤抗原的多特性CAR-T細(xì)胞療法。其中，雙靶點(diǎn)CAR-T的開(kāi)發(fā)在近幾年已經(jīng)取得了不錯(cuò)的進(jìn)展。例如，去年在復(fù)發(fā)B細(xì)胞惡性腫瘤患者中調(diào)查CD19xCD20 CAR-T細(xì)胞療法的首個(gè)I期試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有12例接受高劑量、新鮮生產(chǎn)的雙特異性CAR-T細(xì)胞治療的患者全部有響應(yīng)（第28天ORR為100%，CRR達(dá)92%）[1]。此外，多款CD19xCD22 CAR-T療法的臨床數(shù)據(jù)顯示，這類雙靶點(diǎn)CAR-T總體來(lái)說(shuō)安全性比單靶點(diǎn)要好，ORR在70%-100%之間。

來(lái)源：Blood

在雙靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞療法取得積極成果的同時(shí)，一些研究者也在開(kāi)發(fā)同時(shí)靶向三種腫瘤抗原的CAR-T細(xì)胞療法。該領(lǐng)域較早的一篇文獻(xiàn)于2017年發(fā)表在Blood雜志上[2]。來(lái)自貝勒醫(yī)學(xué)院的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了同時(shí)靶向CD19、CD20 以及CD22的三特異性CAR-T療法。

在該研究中，科學(xué)家們?cè)O(shè)計(jì)了兩種三特異性CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品。一種是使T細(xì)胞表面分別表達(dá)三個(gè)獨(dú)立的CAR（TriCAR），這些CAR的胞外域分別來(lái)自靶向CD19、CD20和CD22的單鏈可變片段(ScFv)；另一種產(chǎn)品使T細(xì)胞表達(dá)一個(gè)靶向CD19的CAR，以及一個(gè)靶向CD20和CD22的雙特異性CAR(SideCAR)。所有CAR都與胞內(nèi)信號(hào)域——共刺激分子4-1BB以及T細(xì)胞受體ζ鏈融合（屬于二代CAR）。

利用CD19逃逸模型（CD19陰性復(fù)發(fā)骨髓樣本以及用CRISPR敲除CD19的原發(fā)性ALL樣本），研究測(cè)試了TriCAR和SideCAR-T的有效性，結(jié)果顯示，三價(jià)CAR-T細(xì)胞有效降低了CD19陰性復(fù)發(fā)，可生產(chǎn)IFN-γ和TNF-α，殺死CD19陰性原發(fā)性ALL，相比之下，CD19單靶向CAR-T細(xì)胞對(duì)這些模型無(wú)效。

研究者們認(rèn)為，這些結(jié)果表明，三價(jià)CAR-T細(xì)胞可以有效靶向具有不同抗原譜的原代ALL細(xì)胞，并緩解CD19陰性復(fù)發(fā)。該策略有潛力作為CD19陰性疾病復(fù)發(fā)患者的挽救性治療，以及原發(fā)性ALL的前線治療。

來(lái)源：Science Translational Medicine

3月24日，發(fā)表在Science Translational Medicine雜志上的一項(xiàng)研究中，來(lái)自Miltenyi Biotec子公司Lentigen的一個(gè)科學(xué)家團(tuán)隊(duì)報(bào)道了三特異性CAR-T療法研發(fā)方面的一項(xiàng)最新進(jìn)展[3]。該研究證實(shí)，同時(shí)靶向CD19、CD20和CD22的三特異性duoCAR-T細(xì)胞療法在體外能夠有效殺死抗原異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞混合物。此外，在小鼠模型中，三特異性duoCAR-T細(xì)胞療法也成功控制了抗原異質(zhì)性腫瘤的負(fù)擔(dān)。

具體來(lái)說(shuō)，在該研究中，為了克服B細(xì)胞腫瘤抗原逃逸，科學(xué)家們利用編碼兩種CAR開(kāi)放閱讀框的慢病毒載體設(shè)計(jì)了三特異性duoCAR-T細(xì)胞。duoCARs由一種“串聯(lián)CD19 binder (scFv)和CD20 binder(scFv)的CAR通過(guò)P2A自裂解肽連接到另一種靶向CD22的CAR上組成。研究評(píng)估了多種細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)基序組合，最有效的duoCAR結(jié)構(gòu)包含ICOS、OX40或CD27共刺激域，而不是CD28或4-1BB。

DuoCARs D1、D2、 D3和D4的設(shè)計(jì)、表達(dá)和特征（來(lái)源：Science Translational Medicine）

在確定4種最佳的binder和信號(hào)域組合后（如上圖A：D1、D2、 D3和D4），研究者們開(kāi)始評(píng)估duoCAR-T細(xì)胞的功能?？乖?yáng)性細(xì)胞系Raji淋巴瘤(CD19+CD20+CD22+)和REH B-ALL (CD19+CD20?CD22+)被用來(lái)測(cè)試duoCAR-T細(xì)胞以抗原特異性方式溶解腫瘤細(xì)胞的能力。結(jié)果顯示，duoCAR-T細(xì)胞與單CAR-T細(xì)胞一樣，以劑量依賴的方式裂解靶點(diǎn)陽(yáng)性（target-positive）腫瘤細(xì)胞系。

接著，研究者們繼續(xù)調(diào)查duoCAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的療效。他們?cè)赗aji非霍奇金淋巴瘤(NHL)異種移植模型和NALM-6急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）模型測(cè)試了DuoCARs，這兩種腫瘤細(xì)胞均是CD19+CD20+CD22+三陽(yáng)性，腫瘤細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞都是通過(guò)尾靜脈注射。結(jié)果顯示，DuoCAR-T細(xì)胞可在體內(nèi)清除彌漫性CD19+CD20+CD22+Raji和NALM-6腫瘤。

DuoCAR-T細(xì)胞在淋巴瘤和白血病的異種移植模型中根除了B細(xì)胞腫瘤（來(lái)源：Science Translational Medicine）

在證明duoCARs能夠在體內(nèi)介導(dǎo)CD19+CD20+CD22+NALM-6和Raji腫瘤的排斥反應(yīng)后，研究人員繼續(xù)調(diào)查了是否單個(gè)抗原也能觸發(fā)duoCAR-T細(xì)胞的激活。他們將過(guò)表達(dá)CD19、CD20或CD22其中一種抗原的A431腫瘤細(xì)胞系克隆，以及基因敲除了CD19、CD20 或 CD22后只表達(dá)其它兩種抗原的Raji克隆，與 duoCAR-T共培養(yǎng)。結(jié)果證實(shí)，表達(dá)最優(yōu)duoCAR的原代人類T細(xì)胞在面對(duì)只表達(dá)CD19、CD20 或 CD22其中一種抗原的細(xì)胞，和三種抗原中其中一種為陰性（CD19陰性、CD20陰性或CD22陰性）的淋巴瘤細(xì)胞系中，均顯示出了強(qiáng)大的抗腫瘤反應(yīng)。

知識(shí)卡：CD19、CD20和CD22均為B細(xì)胞抗原。A431鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系天然缺乏B細(xì)胞表面分子的表達(dá)。該研究通過(guò)基因工程手段，使A431細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)CD19、CD20或CD22其中一種抗原。表達(dá)CD19單抗原的A431細(xì)胞克隆被定義為A19，表達(dá)CD20單抗原的A431細(xì)胞克隆被定義為A20，表達(dá)CD22單抗原的A431細(xì)胞克隆被定義為A22。結(jié)果顯示，所有四種duoCAR-T細(xì)胞都能有效裂解A19、A20和A22靶細(xì)胞。

此外，為了檢測(cè)duoCAR-T細(xì)胞對(duì)抗原丟失型腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤功能，科學(xué)家們將Raji19KO細(xì)胞（敲除CD19的Raji細(xì)胞）、Raji20KO細(xì)胞、Raji22KO細(xì)胞和親代Raji細(xì)胞(各占25%)的混合物植入NSG小鼠。這種Raji細(xì)胞克隆代表了一種靶點(diǎn)異質(zhì)性（target-heterogeneous）腫瘤，在這類腫瘤中，一些腫瘤細(xì)胞會(huì)失去了某個(gè)靶抗原的表達(dá)，從而阻止了相應(yīng)的CAR-T細(xì)胞的激活。在研究的第14天，研究者們發(fā)現(xiàn)所有的duoCAR-T細(xì)胞都能有效排斥異質(zhì)性Raji腫瘤，且在研究結(jié)束時(shí)duoCAR-T細(xì)胞治療依然使小鼠維持在緩解狀態(tài)。相比之下，單靶向CAR（monoCAR）-T細(xì)胞都未能阻止腫瘤進(jìn)展。

在抗原異質(zhì)性的Raji腫瘤模型中，duoCARs的體內(nèi)抗腫瘤活性和持久性（來(lái)源：Science Translational Medicine）

總結(jié)來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明，對(duì)于B細(xì)胞惡性腫瘤患者來(lái)說(shuō)，多特異性duoCAR-T細(xì)胞可能是防止抗原丟失介導(dǎo)復(fù)發(fā)或靶抗原下調(diào)的一種非常有前途的策略。此外，研究也表明，三特異性靶向策略有望解決治療抗原異質(zhì)性癌癥所面臨的挑戰(zhàn)。

專 家 點(diǎn) 評(píng)

優(yōu)卡迪 CEO 俞磊博士

• 突破之處與潛在挑戰(zhàn)

發(fā)表在Science Translational Medicine上的這項(xiàng)新成果報(bào)道了一款三特異性CAR-T療法，該產(chǎn)品可以同時(shí)靶向CD19、CD20和CD22，且在臨床前研究中表現(xiàn)出極好的抗腫瘤活性。文章所介紹的具有識(shí)別三個(gè)不同抗原的三靶-CAR設(shè)計(jì)是在已有雙靶-CAR基礎(chǔ)上進(jìn)一步的拓展，其優(yōu)勢(shì)在于可以同時(shí)應(yīng)答三種不同的細(xì)胞表面抗原，具有潛在克服因腫瘤異質(zhì)性或抗原逃逸而造成的“復(fù)發(fā)”的幾率。但這種設(shè)計(jì)也存在潛在的挑戰(zhàn)性，包括1）三個(gè)scFv靶向分子的空間結(jié)構(gòu)的互相干擾，和2）同一個(gè)產(chǎn)品“脫靶”幾率的增加，造成增加了因“脫靶”而出現(xiàn)的臨床副作用發(fā)生率的增加和嚴(yán)重性不確定性。

該研究小組同時(shí)對(duì)比使用了多款CAR載體分子，包括Single CAR、Tandem CAR、duoCAR，還進(jìn)行了不同共刺激域組合研究，用到的共刺激域分子有4-1BB、ICOS、OX40、CD27、CD28。對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，最有效的CAR結(jié)構(gòu)包含ICOS、OX40或CD27信號(hào)結(jié)構(gòu)域，而不是CD28或4-1BB信號(hào)結(jié)構(gòu)域。最終該研究小組確定了四種最佳duoCAR元件組合，對(duì)于負(fù)荷抗原異質(zhì)性淋巴瘤細(xì)胞的小鼠，duoCAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。該項(xiàng)研究為如何來(lái)克服腫瘤抗原丟失引起的CAR-T治療后短期復(fù)發(fā)問(wèn)題展現(xiàn)了一個(gè)潛在的新解決思路，但從另一個(gè)角度看，這樣的設(shè)計(jì)也帶來(lái)了一定的局限性：三個(gè)以上靶分子（scFv）-CAR分子的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)和保持多靶分子的靶向功能的挑戰(zhàn)性與腫瘤異質(zhì)性的多樣性的矛盾。

• 三靶點(diǎn)CAR-T仍需驗(yàn)證

總體來(lái)說(shuō)，三特異性CAR-T療法無(wú)疑是在雙靶-CAR-T的基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)增加抗腫瘤抗原的靶向分子而增加了抗復(fù)發(fā)的保險(xiǎn)。三靶向-CAR技術(shù)理論上來(lái)說(shuō)可以對(duì)抗早期復(fù)發(fā)的臨床問(wèn)題，但目前該技術(shù)還處于臨床前研發(fā)階段，后續(xù)還有大量的工作需要去做，以進(jìn)一步檢驗(yàn)該技術(shù)的成藥性，比如臨床前毒性研究、產(chǎn)品開(kāi)發(fā)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、適應(yīng)人群確定、給藥劑量、給藥時(shí)間等。

• 雙靶點(diǎn)CAR-T數(shù)據(jù)積極

CD19或CD22靶向CAR-T療法雖然可以有效改善B細(xì)胞白血病和淋巴瘤的治療效果，但 CAR-T治療后的短期復(fù)發(fā)問(wèn)題仍是制約CAR-T技術(shù)發(fā)展的因素之一。斯隆·凱特琳紀(jì)念癌癥中心（MSKCC）隨訪數(shù)據(jù)顯示，多達(dá)50%的CAR19 T細(xì)胞治療患者在治療后第一年內(nèi)復(fù)發(fā)，其中相當(dāng)一部分表現(xiàn)出CD19抗原丟失。因此，單一靶點(diǎn)的細(xì)胞治療模式可能會(huì)喪失治療優(yōu)勢(shì)，而多靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞治療模式會(huì)是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

相較于剛剛起步的三特性CAR-T，業(yè)界在開(kāi)發(fā)雙靶點(diǎn)CAR-T療法方面已經(jīng)做了很多努力，且獲得了一些積極進(jìn)展。舉例來(lái)說(shuō)，在2020 ESMO大會(huì)上，Autolus Therapeutics公司公布了其靶向CD19/CD22的雙靶點(diǎn)CAR-T療法AUTO3的臨床數(shù)據(jù)，中位隨訪6個(gè)月時(shí)，93%完全緩解的患者仍未出現(xiàn)復(fù)發(fā)。

早在2016年優(yōu)卡迪就開(kāi)始布局多靶點(diǎn)CAR-T產(chǎn)品，我們圍繞雙靶點(diǎn)CAR-T技術(shù)主要做了血液瘤和實(shí)體瘤兩個(gè)方向的布局。在血液瘤方向，我們已建立包含CD19/CD20、CD19/CD22、CD19/CD30等多款雙靶點(diǎn)產(chǎn)品在內(nèi)的研發(fā)管線，這些產(chǎn)品目前均已經(jīng)處于臨床試驗(yàn)階段，此外，管線還包含雙靶與PDL1 Blocking技術(shù)聯(lián)合的三靶向產(chǎn)品。在實(shí)體瘤方面，考慮到實(shí)體腫瘤抗原異質(zhì)性較高，我們認(rèn)為更需要通過(guò)雙靶CAR設(shè)計(jì)來(lái)解決抗原異質(zhì)性和抗原丟失的問(wèn)題，比如HER2和MUC1雙靶點(diǎn)聯(lián)合治療乳腺癌，HER2和IL-13Rα2雙靶點(diǎn)聯(lián)合治療膠質(zhì)瘤。

• CAR-T未來(lái)突破方向

展望未來(lái)幾年，我認(rèn)為， CAR-T領(lǐng)域需要從解決臨床需求出發(fā)，在以下幾個(gè)方面進(jìn)行突破：1）首先是安全性，一方面需要通過(guò)對(duì)靶抗原精準(zhǔn)性和可控性的提高，減少“脫靶”，另一方面，也要開(kāi)發(fā)出針對(duì)嚴(yán)重CRS和ICAN的預(yù)防策略；2）第二是治療后復(fù)發(fā)問(wèn)題的改善，可通過(guò)多靶策略，深度清除腫瘤細(xì)胞，此外，也要想辦法提高CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)的持久性等；3）第三是新型通用型CAR-T的技術(shù)和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，努力降低基因編輯在技術(shù)層面的“脫靶”幾率，獲得真正達(dá)到能和自體CAR-T具有相似有效性、安全性和持續(xù)性的“通用型CAR-T”產(chǎn)品；4）第四是攻克實(shí)體瘤，由于腫瘤的多樣性和腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性，聯(lián)合治療模式的開(kāi)發(fā)也是未來(lái)需要突破的方向，如溶瘤病毒與CAR-T療法結(jié)合，PD-1/CTLA-4抗體與CAR-T療法結(jié)合和CAR-療法與其它免疫細(xì)胞療法的結(jié)合，如CAR-NK、CAR-M等。