前沿 | PROTAC連接基團（Linker）的設計與優化

來源：藥智網|青梅

1. 簡介

自 2001年第一次概念驗證以來，小分子誘導的靶向蛋白質降解逐漸成為藥物研發的一個熱門方向。用于誘導降解的策略主要有兩種，一是使用可以改變E3連接酶底物識別域的小分子，即所謂的分子膠，從而允許募集新底物進行蛋白水解； 二是使用嵌合小分子，該小分子由與結合所需靶蛋白的模塊連接的E3連接酶結合部分組成。本文將主要討論后者。

靶向嵌合體（PROTAC，也稱為 SNIPER、uSMITE 或降解劑）和雙功能小分子降解劑由于其催化活性（效力）、通過蛋白間相互作用誘導同工酶選擇性的能力以及偏離“五規則”而廣為人知。PROTAC能夠同時結合E3連接酶的底物識別域和感興趣的蛋白質(POI)，從而誘導非同源泛素化和隨后的POI降解。目前有六種獨特的嵌合降解劑分子在人體中的效用正在通過臨床試驗中進行研究。PROTACs的獨特代謝活性來自于它們能夠從泛素-蛋白酶體系統 (UPS) 中適當地使用RING泛素連接酶，該系統通過用多聚泛素鏈標記蛋白質來調節蛋白質穩態，從而標記它們進行蛋白水解。

PROTAC的效力和同工酶選擇性可以通過連接基團（Linker）內的構-效關系 (SAR) 進行優化。連接部分的長度和化學成分已被證明會影響 PROTAC的結構剛性、疏水性和溶解性等。目前，關于連接部分的長度部分的SAR研究主要還是經驗性的，是一項時間和勞動密集型的工作。雖然通過結構生物學和計算研究在合理的PROTAC設計方面取得了很大進展，但連接基團的設計、合成依然是一項繁重的工作。Michael D. Burkart等最近發表在Journal of Medicinal Chemistry的觀點文章，闡述了接頭設計在靶向嵌合體的蛋白水解中的作用。

2. PROTAC中連接基團的優化

2.1 提高合成通量的方法

當前簡化接頭變體SAR研究的方法包括：通過使用正交保護的雙功能接頭固相合成、銅催化點擊化學、活化酯、和Staudinger連接化學來提高合成通量（圖1）。有許多策略已被證明可以實現基于免疫調節酰亞胺藥物（CRBN 招募）系統的 PROTAC接頭變體套件的模塊化合成，但到目前為止它們似乎都沒有在該領域得到廣泛應用。盡管所提出的大多數策略都可以轉化為VHL（Von Hippel?Lindau）或其他E3連接酶招募系統，但只有銅催化的點擊平臺特別證明了這一點，然而將三唑部分引入接頭可能不會產生理想的物理化學由于其高拓撲總極性表面積。所有這些策略都將從功能化（炔烴、Boc 保護的胺末端或疊氮化物末端）連接的E3連接酶配體庫的可用性中受益匪淺。實際上，許多合成模塊可以購買到。

圖1. 已發表的用于合成PROTAC的合成方法。

2.2 合理的PROTAC連接基團的設計

2.2.1 利用X-ray晶體學數據和計算模型合理設計PROTAC

Gadd等人解決了三元復合物中降解劑（MZ1）的第一個 X 射線結構，使用這些數據，他們能夠合理地設計出更具選擇性的溴結構域降解劑（AT1）。Farnaby及其同事能夠從SMARCA2:PROTAC 1:VHL (PDB 6HAY)的共晶結構中識別 PROTAC 1的PEG接頭和VHL之間關鍵的穩定相互作用。基于這些數據，他們在不犧牲產生ACBI1的關鍵PEG相互作用的情況下，通過在接頭區域插入苯基部分引入了額外的T形堆積相互作用并增加了剛性（圖2a）；一種改進的SMARCA2/4降解劑。

Nowak等通過使用一組X射線結構進行RosettaDock模擬，基于已知的泛溴域降解劑dBET6（圖2b）開發了一種新型BRD4選擇性降解劑ZXH-3-26相關的、PROTAC結合的三元復合物。結構預測還表明，PROTAC接頭長度的最小化將通過減少POI-PROTAC-連接酶三元復合物的有利結合模式的數量來提高降解劑的選擇性。

Testa等使用 BRD4BD2和VHL與已知溴結構域降解劑 MZ1 (PDB 5T35) 結合的復合物的分子動力學模擬，確定了一種有效的異構體選擇性（BRD4BD2選擇性）溴結構域降解劑（圖2c）。

圖2. 合理設計PROTAC

2.2.2 PROTAC設計軟件開發

為了使用分子操作環境 (MOE) 和開源Rosetta軟件套件合理設計從頭 PROTAC開發，更嚴格的計算方法已經被開發出來了（圖3）。這些方法不僅成功地在計算機上重現了從X射線晶體學中確定的PROTAC結合模式，而且還與基于先前生物學評估的效力和選擇性趨勢一致。

Drummond等使用MOE軟件套件開發了一系列用于生成和分析PROTAC三元復合物的協議（圖3a）。在這些協議中，最有效的方法是在沒有POI和連接酶的情況下對降解劑的構象空間進行采樣，以識別在后續步驟中將進行對接模擬的降解劑構象。

Zaidman等人使用開源Rosetta軟件套件來開發PROsettaC（圖3b）。就此而言，PROsettaC與Drummond等開發的相似，因為兩個配體與其各自目標的二元復合物的結構是必要的輸入。

Bai等人描述了另一種基于Rosetta的協議（圖3c）。該協議仍然依賴配體結合的二元 X 射線晶體結構作為初始輸入，但是它使用了最初為抗體-抗原對接開發的全局對接協議來生成不同姿勢的POI 和關于固定的配體位置的連接酶的初始集合。

總體而言，這些研究表明PROTAC開發受益于計算機輔助優化。計算機中PROTAC開發的目標旨在通過最大限度地減少合成和生物評估分子的數量來提高通量，以便令人滿意地降解目標蛋白質。

圖3. PROTAC計算方法開發的最新進展

2.3 連接基團的經驗SAR

通過對文獻報道的連接基團長度與降解效率之間的關系進行統計分析，作為測試 E3連接酶和POI之間兼容性的一種手段，可能最好以較長的接頭長度開始經驗性接頭長度 SAR 研究。然而，數據并不一定表明任何大于最佳長度的接頭都會產生成功的降解劑；只是一般來說，由于沒有空間沖突，較長的連接子會增加找到降解劑的機會。

3. 總結

PROTAC開發活動的經驗性質正在被嵌合小分子合成方法、三元復合物的結構表征、計算協議的進步以及對先前研究的系統分析的均衡發展所逐漸替代。PROTAC開發為藥物設計提供了一個戲劇性的彎路，因為重點已經轉移到能夠穩定非同源蛋白質相互作用足夠長的小分子以進行多泛素化。這種事件驅動的藥理學使得重新利用因缺乏效力或缺乏選擇性而被擱置的先前廢棄的配體成為可能。它還提供了一種有效靶向非催化蛋白質靶標的方法，顯著擴展了潛在的先導化合物。通過本文所描述的專業領域之間的持續合作，期望能夠通過開發處能夠替代連接基團經驗性質的方案來減少PROTAC的開發時間。

參考文獻：

Troy A. Bemis, James J. La Clair, and Michael D. Burkart* Unraveling the Role of Linker Design in Proteolysis Targeting Chimeras. J. Med. Chem. 2021.

責任編輯：琉璃

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