教授，博士生導師。本科和碩士畢業于第二軍醫大學藥學院，1999 年博士畢業于華西醫科大學藥學院。教育部新世紀優秀人才、上海市優秀學術帶頭人、上海市曙光學者、上海高校優秀青年教師。中國顆粒學會生物顆粒專委會副主任委員、世中聯中藥藥劑學第三屆理事會副會長、中國藥學會藥劑學專業委員會委員、中國醫藥生物技術協會納米生物技術委員會常務委員、國家食品藥品監督管理局藥物審評專家等。J Biomed Nanotech 副主編、AAPS PharmSciTech、Arch Pharm Res、Asian J Pharm Sci、Curr Drug Deliv、DrugDeliv Lett、Heliyon、Int J Pharm、J Chin Pharm Sci、J Drug Deliv Sci Tec、《藥學學報》、《中國醫藥工業雜志》、《藥學進展》等 10 余本國內外知名雜志編委。Acta Pharm Sin B、Adv Drug Deliv Rev、Int J Pharm、Pharmaceutics 客座編輯。已發表論文 200 余篇，其中 SCI 論文 120 余篇。

盧懿，黃味子，戚建平，吳偉 * 

（復旦大學智能化遞藥教育部重點實驗室，上海 201203）

[摘要]納米結晶在難溶性藥物的遞送方面具有重要的應用前景，但人們對其作用機制仍所知有限。通過物理嵌入方式制備的雜化熒光探針納米結晶，為體內示蹤提供了強有力的工具。在簡要介紹當前納米結晶體內命運研究進展的基礎上，詳細介紹了雜化納米結晶的基本概念、制備方法及技術發展歷程，重點闡述基于聚集導致淬滅熒光探針的納米結晶技術，以及由此獲得的納米結晶經口服、注射和滴眼給藥的體內命運。

納米結晶是粒徑在幾十到幾百納米范圍的藥物晶體，由于其顯著地增加了藥物顆粒的比表面積，可以極大地提高難溶性藥物的溶出度，進而改善其口服生物利用度，降低個體差異。因此，納米結晶技術最早被用于解決難溶性藥物的口服給藥難題，并取得了巨大成功，迄今已經有 10 余種藥物的納米結晶口服制劑上市。納米結晶也可以混懸于溶液中用于注射給藥，具有類似于納米載體的遞藥性能。此外，由于不使用載體材料，納米結晶理論載藥量高達 100%，也可避免由載體材料帶來的安全性問題。近年來美國 FDA 批準的用于靜注治療惡性高熱的 Ryanodex?（丹曲林鈉）即是納米結晶制劑，一瓶的劑量即可滿足 1 名成年患者的治療需求，從配制到注射也僅需 1 min 即可完成，而傳統的丹曲林鈉制劑在使用時需要將 12 瓶的劑量混合，配制時間更是長達 20 min，不利于惡性高熱這種急癥的治療。這些上市藥物制劑的成功推動了納米結晶技術的迅速發展，除了口服與注射途徑外，納米結晶在經皮給藥、眼部給藥和肺部給藥方面也表現出巨大的應用前景。

人們對于納米結晶的體內過程仍然所知有限，甚至可能存在錯誤的認識。其中一個重要的原因在于，納米結晶不含載體材料，不能像其他載體粒子那樣對材料進行化學標記，進而通過熒光或放射性同位素追蹤其體內轉運過程。目前，對納米結晶體內過程的研究主要基于藥物的動力學和體內分布的數據，然而這些數據并不能解釋納米結晶的體內行為。這是因為，這些數據的獲得需要從血液或組織中提取藥物分析含量，提取的過程無法區分完整的納米結晶和溶解的游離藥物，由此推測得到的納米結晶體內過程可能形成錯誤的結論。

近年來，普渡大學的 Li 等成功研發雜化納米結晶技術，通過將熒光探針或顯影分子以物理包合的形式雜化入藥物的晶格，使其發出熒光。這種技術可以在不改變藥物的晶體性質和理化性質的基礎上實現納米結晶的體內示蹤，為納米結晶體內命運的研究提供了強有力的工具。本文在簡要介紹當前納米結晶體內命運的研究方法基礎上，詳細介紹雜化納米結晶技術的基本概念和發展過程，并綜述了基于雜化聚集導致淬滅（aggregation-causedquenching，ACQ）熒光探針的納米結晶體內命運最新研究進展。

1納米結晶體內命運研究方法

1.1 透射電子顯微鏡

在組織器官中觀察納米結晶的結構是研究其體內命運最直接的方法，常用的觀察工具是透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）。Rabinow 等靜脈注射伊曲康唑納米懸液后，通過TEM 在大鼠脾臟切片中觀察到了巨噬細胞內的藥物結晶，據此推測納米結晶注射后可能迅速被巨噬細胞吞噬，進而改變其藥動學行為和體內分布特征。Fu 等對大鼠灌胃給予尼莫地平納米結晶制劑后，在大鼠腸系膜淋巴液中觀察到了結晶顆粒，進而推測納米結晶口服后可以被整體攝取。TEM 超高的分辨率是從生物組織背景中識別細小的藥物納米結晶的基礎，但為了分辨納米顆粒，觀察視野往往被限制于非常狹小的區域之中，無法提供機體水平的轉運和分布情況，及其動態過程。更為重要的是，TEM 的制樣過程可能嚴重影響結果的準確性；現有研究中均使用乙醇進行組織脫水，勢必使得未溶解的藥物納米結晶溶解，而后續步驟除去乙醇又會導致藥物結晶析出；此外，染色劑引入的結晶性物質也可能干擾對結果的判斷。

1.2 熒光藥物

采用自身具有熒光的藥物制備納米結晶，可以通過熒光信號監測其體內轉運過程。比如，通過激光掃描共聚焦顯微鏡研究姜黃素納米結晶的透皮轉運；借助熒光分子香豆素 6 研究納米結晶在馬丁達比犬腎上皮細胞和斑馬魚幼體中的轉運機制；以及用可水解的二乙酸熒光素開展納米結晶眼部轉運研究。雖然這些研究對揭示納米結晶的體內命運具有重要參考價值，但該方式嚴重依賴藥物的自發熒光，并不具備普適性。由于藥物自身的理化性質（如溶解度、解離常數、油水分配系數）對于其納米結晶的體內命運有極大影響，從少量模型藥物中獲得的研究結果并不能外推到所有藥物的納米結晶。更為重要的是，這些藥物溶解后也能發出熒光，研究者所觀察到的熒光信號實際是源于完整的納米結晶和溶解的藥物分子。隨著時間的延長，更多藥物溶解，熒光信號更多地呈現出藥物分子的體內行為，與納米結晶的差異越來越大。

2雜化納米結晶

2.1 基本概念

雜化結晶屬于固體化學中客體包合的范疇，是自然界中較為常見的現象，比如，彩鉆、高碳鋼和半導體等。一般地，雜化微量的客分子即可顯著改變主分子的外觀、機械強度和導電性等性能，但并不會改變主分子的晶體性質。這些現象促進了雜化納米結晶技術的發展，其初衷在于發展一種診療一體的藥物遞送技術，即將顯影劑、配體或生物相容性聚合物雜化在藥物的納米結晶中，結晶的溶解使得配體和聚合物暴露于納米結晶表面，進而實現長循環或靶向遞送。顯影劑則可示蹤納米結晶的體內轉運過程及在疾病部位的變化情況（見圖 1）。除了熒光探針外，放射性核素或金屬顯影劑也可通過其對應的顯像設備起到定位作用。

2.2制備方法

雜化納米結晶的制備可以采用傳統的納米結晶制備方法，即由上到下（top-down）或由下到上（bottom-up）工藝，直接在制備過程中引入顯影劑即可實現雜化。方便起見，雜化納米結晶的制備多以由下到上工藝為主，即溶劑-非溶劑沉淀的方法，其基本過程為：根據顯影劑的親疏水性質，將其溶解在藥物溶液中或非溶劑中，一定條件下使藥物溶液與非溶劑混合，藥物結晶析出并將顯影劑雜化入晶格。比如，親水性熒光分子 FPR-749、熒光素和羅丹明 B 水溶性好，可溶解在水中作為非溶劑；而親脂性熒光分子 DiD、DiR、Cy5 等則溶解在藥物的有機溶劑中。熒光分子的大小和親疏水等性質會影響其包載效率，但藥物晶體中熒光分子的包載率通常較低，絕大多數小于 1%，平均載量更是低于 0.1% 。有限的熒光包載量使得雜化納米結晶和純藥物納米結晶具有相同的粒度、形態和結晶度，因此，從雜化納米結晶中獲得的研究結果可以反映藥物納米結晶的性質。由上到下工藝也可用于制備雜化納米結晶，但一般需要先通過由下到上方法將熒光探針雜化到藥物晶體中，再通過高壓乳勻機等提供的機械力將雜化結晶打碎至理想的粒徑。

2.3技術發展

2.3.1 第一代雜化納米結晶 第一代雜化納米結晶處于概念發展階段，受到當時認知的局限，研究者往往使用常規的熒光探針（即其熒光性質不具有環境響應性）制備雜化納米結晶。Zhao 等率先采用親水性熒光分子 FPR-749、熒光素和羅丹明 B 制備雜化納米結晶，其優勢在于可以通過過濾將未雜化的探針分子除去。此外 Zhao 等對熒光探針的雜化量進行了考察，以熒光素為模型，發現不同雜化量的雜化納米結晶都能發出熒光，但當雜化率為0.86% 及以下時，雜化納米結晶完全溶解時（對應0.002 mg · L-1 及以下的熒光素水溶液）卻不能發出熒光。據此，他們確定了熒光素的雜化量。也有研究者采用親脂性熒光探針（如 DiD、DiR、Cy5 等）制備雜化納米結晶，相對于親水性熒光分子，其在溶劑-非溶劑沉淀的過程中，未雜化的熒光分子本身也可能結晶析出形成納米結晶，將其從藥物雜化納米結晶中分離出來卻并不容易。

隨著研究的不斷深入，第一代雜化納米結晶的弊端逐漸顯露，主要在于所采用的熒光探針不具有環境響應性，無論是雜化于納米結晶中還是由于結晶溶解而釋放出來的探針均能發出熒光，基于這些熒光信號得到的結論可能造成誤導。Hollis 等制備了 3H 標記紫杉醇雜化納米結晶，通過活體成像觀察荷瘤小鼠中雜化納米結晶靜脈注射后的熒光分布，同時通過閃爍計數測量紫杉醇的體內分布，發現藥物的體內分布與熒光的分布存在差異，且這種差異隨著時間推移更加明顯。主要原因在于隨著納米結晶的溶解，更多的探針分子被釋放出來，由于不具備環境響應性，這些探針分子仍然釋放出熒光，由熒光信號得到的結果實際上反映了這些探針分子的體內分布情況，而探針分子與紫杉醇的理化性質上的差異造成了其體內行為及分布上的差異。

2.3.2 第二代雜化納米結晶 為了準確地追蹤納米結晶的體內行為，關鍵問題在于如何區分雜化納米結晶信號和游離探針分子的信號，這必然要求探針分子具有環境響應性。聚集誘導發光（aggregationinduced emission, AIE）、ACQ 和熒光共振能量轉移（f?rster resonance energy transfer, FRET）等熒光探針具有獨特的環境響應特性，雜化這些熒光探針的第二代雜化納米結晶獲得了“自我識別”能力。

2.3.2.1 聚集誘導發光熒光探針基本原理 AIE 是探聚集誘導發光熒光探針基本原理 AIE 是探針分子聚集后發出熒光的現象。以典型的四苯基乙烯（tetraphenylethylene, TPE）分子為例，其分子中的 4 個苯環通過剛性的乙烯基連接，處于分子分散狀態（如溶解在有機溶劑中）時，芳香基團可以旋轉或扭轉，激發態以熱衰減的形式回到基態而不發出熒光；一旦TPE 分子聚集（如形成沉淀），分子運動受阻，激發態的耗散只能通過光子發射來實現。當把 TPE 分子雜化在藥物納米結晶中時，由于分子運動受到限制，能夠發出熒光；一旦結晶溶解釋放出 TPE 分子，若其能夠保持溶解狀態，則分子運動恢復，熒光淬滅。相對于傳統的探針分子，AIE 可以有更大的使用量，因為探針分子間聚集反而可以增加熒光強度，不用擔憂熒光淬滅的現象發生。但其用量也不能無限制增加，過載也會導致和常規熒光基團類似的熒光衰減甚至完全淬滅。需要注意的是，由于疏水性較強，納米結晶溶解后釋放的 AIE 分子可能沉淀析出，從而帶來熒光干擾。而且，AIE 探針的發射波長通常小于 600 nm，限制了其在體內研究的應用，目前主要用于細胞實驗，研究納米結晶與細胞間相互作用機制。

2.3.2.2 聚集導致淬滅熒光探針基本原理 ACQ 現象正好與 AIE 相反，其廣泛存在于具有芳香共軛結構的熒光分子中，由于這些熒光分子具有強疏水性的平面結構，在水環境中易受到疏水力作用發生 π-π 堆疊，分子聚集導致熒光淬滅。ACQ 被普遍認為是熒光探針的缺點，并在新探針的研發中極力避免，但是，ACQ 性質卻在納米粒的自我識別方面具有獨特的優勢。最近，一系列具有氟化硼二吡咯（BODIPY）或氮雜氟硼二吡咯（aza-BODIPY）母體結構的 ACQ 近紅外探針在納米粒的體內命運研究中嶄露頭角。它們以分子形式包載于納米粒的疏水骨架中時，可以發出強烈的近紅外熒光，一旦骨架破裂，探針釋放遇水，則發生分子間聚集，導致熒光完全淬滅。由于水在機體內無處不在，可以通過熒光信號準確地追蹤納米載體的體內轉運過程。類似地，這些 ACQ 探針也可以被用于實現納米結晶的“自我識別”。但是，聚集的 ACQ 探針也可能在體內重新溶解于內源性的磷脂/膽鹽膠束或囊泡，以及脂肪組織，從而出現熒光復現干擾檢測。因此，采用 ACQ熒光探針時往往需要設計探針的水溶液淬滅組作為對照，以評估熒光復現的強度。

2.3.2.3 熒光共振能量轉移熒光探針基本原理 FRET 是發生在供體分子熒光團和受體分子熒光團的非輻射能量轉移現象。當供體分子的發射光譜與受體分子的激發光譜重疊，且 2 分子距離很近時，FRET 效應發生，該效應的熒光強度與 2 個生色團之間的距離的 6 次方成反比。因此，當 FRET 熒光對被包載于納米載體中時，分子間距離較近，以供體分子激發光激發時，可以發出 FRET 熒光（FFRET），而一旦熒光對從納米載體中釋放出來，分子間距離增加，FRET 效應消失，只能發出供體分子的熒光（F 供體）。不同于 AIE 和 ACQ 的熒光消失，FRET 通過發射光波長的轉變實現納米載體的“自我識別”。將 DiO/DiI 熒光對雜化于五味子甲酯納米結晶，通過 FFRET/F 供體或 FFRET/（FFRET + F 供體）的變化可實現對納米結晶的細胞攝取、轉運過程及胞內溶解動力學等的監測。不過 FRET 的受體-供體體系對實驗設計和后續分析提出了額外的挑戰。為了實現定性和半定量納米結晶的行為，需要謹慎挑選熒光分子對使 FRET 熒光穩定性最大化且具有一定強度，并保證 2 種生色團的熒光強度具有可比較性。另一個挑戰來自 FRET 熒光自身不夠理想的環境穩定性和光穩定性。不同波長熒光對的組織穿透能力差異對納米結晶體內研究結果的準確性也存在一定影響。

3雜化 ACQ 探針納米結晶體內命運研究進展

鑒于目前第二代雜化納米結晶中，雜化 AIE 和FRET 探針的結晶主要用于細胞實驗，本部分介紹通過雜化 ACQ 探針研究納米結晶體內命運的進展情況。

3.1 口服給藥

將藥物晶體粉碎至納米尺度，可以顯著增加其比表面積，進而顯著促進難溶性藥物的溶出和口服生物利用度。體外溶出和體內生物利用度的研究結果無不證明了這些特點，因而，人們推測納米結晶口服后在體內迅速溶解。但是，體外溶出條件與體內實際情況存在明顯差異，比如，胃腸道的蠕動遠遠弱于體外溶出攪拌的劇烈程度，另外，胃腸道中的水分也極為有限，這些因素并不利于納米結晶的迅速溶解。如果納米結晶在胃腸道中可以滯留一定時間，則可能與小腸細胞產生相互作用。

Xie 等和 Shen 等分別以雜化 ACQ 探針的環孢素 A 納米結晶和槲皮素納米結晶為模型進行了系列研究。2 種藥物雜化納米結晶的溶出過程和熒光淬滅是一致的。圖 2 展示了 2 種粒徑（250 和 550 nm）環孢素 A 雜化納米結晶體外溶出過程殘余納米結晶含量和殘余熒光強度的經時變化曲線，相關性分析表明兩者具有很好的相關性。因此，ACQ 熒光信號可以準確示蹤完整納米結晶的體內轉運過程。2 種藥物雜化納米結晶灌胃給藥后，其胃腸道中熒光滯留時間均長達 12~18 h，表明納米結晶口服后并不會迅速溶解。此外，口服后大鼠肝臟和肺部等主要器官均發現了熒光信號，這為雜化納米結晶的整體吸收提供了強有力的證據。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察小腸組織的冷凍切片，通過 ACQ 探針信號，也證實了完整的納米結晶可以跨小腸上皮細胞轉運至基底側。

3.2 打印材料

納米結晶注射后的體內行為存在較大的爭議。有研究者認為，由于具有較快的溶出速度，納米結晶注射后在血中迅速溶解，呈現類似于藥物溶液的動力學和體內分布特征。也有學者認為納米結晶注射后能夠在一定時間內保持其結構完整性，可能被巨噬細胞迅速識別和攝取，從而在單核吞噬細胞系統（mononuclear phagocyte system，MPS）的器官和組織蓄積。

Wang 等將 ACQ 熒光探針雜化到姜黃素納米結晶中，研究其注射后的體內行為。結果發現姜黃素納米結晶注射進入人體 48 h 后血液中熒光存留量仍有9.0%±1.3%，表明納米結晶注射后并不能夠迅速溶解。同時在大鼠各個器官中均發現了 ACQ 熒光信號，其在各臟器中的滯留時間由長到短依次為：肝、肺、脾、腎、心和腦，但主要的分布器官為肝和肺，這二者中的熒光占了臟器總熒光的 90% 以上。另外，600 nm 組的熒光強度幾乎在所有器官中都顯著高于 300 nm 組，究其原因，除了小粒徑組溶出速率快以外，也說明大粒徑結晶更易被 MPS 識別、吞噬。

3.3 滴眼給藥

納米結晶載藥量高、刺激性低，巨大的比表面積也使其具有一定的生物黏附力，進而延長其在角膜的滯留時間，有利于藥物在眼部滲透。為了研究納米結晶的眼部給藥后命運，Liu 等將 ACQ 探針雜化于環孢素 A 納米結晶，發現部分納米結晶能以整體形式滲透進入角膜，不過在基質和內皮中觀察到的熒光信號微乎其微，說明納米結晶眼用制劑無法以整體形式穿透角膜，僅能作為藥物貯庫釋放活性分子。

4結語與展望

雜化納米結晶不僅為納米結晶的體內示蹤提供了強有力的工具，也可以發展成為診療一體化的藥物遞送平臺技術。熒光探針的雜化并不需要額外的處理，在納米結晶制備的同時即可實現。由于藥物晶格結構的限制，熒光探針的雜化量往往較低，雖然保證了納米結晶的理化性質不受影響，但對探針分子的熒光量子效率提出了較高的要求。通過活體成像和激光共聚焦顯微鏡可以從動物活體、離體或細胞層面全面解析雜化納米結晶的體內命運和作用機制。環境響應探針的使用為雜化納米結晶的準確示蹤提供了保障，但也需注意熒光復現等現象對結果的干擾。發展新型的環境響應探針，徹底避免熒光復現等干擾問題，才能完善雜化納米結晶技術。值得注意的是，目前的研究以定性結果為主，如果能夠通過熒光強度實現完整納米結晶的定量測定，再結合藥物分子的準確數據，基于這兩點來定量描繪完整納米結晶粒子和藥物在機體內的時空命運，才能真正揭示納米結晶制劑的體內命運，這也是雜化納米結晶技術的重要研究方向。隨著越來越多的難溶性備選化合物的發現，納米結晶技術將具有更為廣闊的應用前景，對于納米結晶的體內命運及影響因素全解析，對于納米結晶制劑的發展具有非常重大的指導意義。

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