鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是一種跟遺傳、環(huán)境等多因素相關(guān)的惡性腫瘤，在中國南方、東南亞等地區(qū)發(fā)病率較高[1]。由于在我國廣東地區(qū)鼻咽癌發(fā)病率遠高于全國平均水平，因此NPC也被稱為“廣東癌”[2,3]。EBV（Epstein-Barr virus）病毒感染是鼻咽癌的主要致癌因素之一，并在其發(fā)生進展過程中扮演了重要的角色[4]。前期研究多數(shù)基于整塊組織或細胞系樣本，無法精細和清晰的呈現(xiàn)腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性。尤其對于鼻咽癌內(nèi)部腫瘤細胞、EBV和腫瘤微環(huán)境（tumour microenvironment, TME）細胞之間的相互作用，缺乏全面系統(tǒng)的認識。

針對此科學研究問題，來自北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心（BIOPIC）、生命科學學院白凡研究員團隊與中山大學腫瘤防治中心曾木圣/鐘茜教授團隊開展合作研究，研究團隊使用最新的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（scRNA-seq），結(jié)合大樣本基因組、轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)，以及流式檢測、多重免疫組化、免疫熒光、CCK-8、ELISPOT、小鼠移植瘤、細胞共培養(yǎng)等多種實驗手段，對鼻咽癌腫瘤微環(huán)境進行了全面系統(tǒng)的剖析研究，并鑒別出一類獨特的“上皮-免疫”雙重特征腫瘤細胞亞群。研究論文“Single-cell transcriptomic analysis defines the interplay between tumor cells, virus infection, and the microenvironment in nasopharyngeal carcinoma”于2020年9月8日，以research article形式在線發(fā)表于著名學術(shù)期刊Cell Research。

在這項研究工作中，研究人員首先利用Smart-seq2和10x Genomics兩種單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)平臺對19個EBV+ NPC患者的腫瘤樣本（其中3例有配對轉(zhuǎn)移位組織），以及7例非腫瘤患者的鼻咽組織樣本應(yīng)用scRNA-seq技術(shù)，共捕獲到大約104,000個單細胞（圖1）。經(jīng)過深入的生物信息學分析，研究人員在單細胞水平全面系統(tǒng)的描繪了腫瘤細胞、EBV、間質(zhì)和免疫細胞等的轉(zhuǎn)錄組圖譜。同時，研究人員在單細胞水平揭示了NPC腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性，以及原位和轉(zhuǎn)移位腫瘤組織潛在的播散關(guān)系。對EBV基因表達圖譜特征分析表明，EBV潛伏期和裂解期基因可在宿主同一腫瘤細胞內(nèi)共表達。

圖1，整體實驗設(shè)計及來自26個樣本的約104,000個單細胞表達譜概況

值得注意的是，研究人員通過對腫瘤單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)應(yīng)用非負矩陣因子分解（non-negative matrix factorization，NMF）方法解析其潛在的差異基因程序，鑒定出一種特殊的腫瘤細胞特異的“上皮-免疫”雙重特征，既腫瘤細胞既表達經(jīng)典的上皮細胞標志物（如EpCAM），又表達一些免疫標志物（如MHC-II類分子，補體基因等）。研究人員進一步結(jié)合免疫組化和bulk-RNA數(shù)據(jù)分析，證實這種雙重特征的腫瘤細胞在鼻咽癌樣本中廣泛存在，并且跟較差的臨床預(yù)后緊密聯(lián)系。研究者通過體外細胞系和小鼠移植瘤模型等功能實驗，揭示出具有該“上皮-免疫”雙重特征的腫瘤細胞展現(xiàn)出較強的成瘤能力（圖2）。

圖2，單細胞水平發(fā)現(xiàn)鼻咽癌腫瘤細胞獨特的“上皮-免疫”雙重特征亞群，該亞群在鼻咽癌樣本中廣泛存在并與臨床較差預(yù)后相關(guān)

接下來，研究人員通過單細胞轉(zhuǎn)錄組分析，全面刻畫了鼻咽癌與非腫瘤鼻咽組織免疫微環(huán)境中的T細胞分群、轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和免疫激活/耐受情況（圖3），以及髓系細胞分群、轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和發(fā)育軌跡。

圖3，單細胞水平刻畫鼻咽癌與非腫瘤鼻咽組織免疫微環(huán)境中的T細胞分群、轉(zhuǎn)錄狀態(tài)和免疫激活/耐受情況

通過計算IFN-α 和IFN-γ表達分值，比較腫瘤來源與非腫瘤來源細胞的各類型細胞IFN分值差異，研究人員發(fā)現(xiàn)NPC腫瘤微環(huán)境中主要細胞類型都有顯著高的IFN-α 和IFN-γ分值，說明這種全局性干擾素響應(yīng)上調(diào)普遍存在于NPC腫瘤微環(huán)境中。這個特征在其他腫瘤中尚未報道，可能反映了病毒感染與腫瘤細胞對腫瘤微環(huán)境的協(xié)同影響這一特質(zhì)。

接下來，研究人員應(yīng)用scRNA-seq數(shù)據(jù)的細胞特異性標記物，對140例未經(jīng)治療的鼻咽癌原位腫瘤組織的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)樣本進行解析，根據(jù)這些基因在腫瘤微環(huán)境中的差異表達特征，將其分為G1-G5共5組亞型。結(jié)合這些數(shù)據(jù)樣本的病例臨床信息，對它們的生存預(yù)后關(guān)系進行了組別分析比較。結(jié)果表明，該分子分型方法為NPC患者臨床預(yù)后提供了一種新的生物標記物（圖4）。

圖4，單細胞數(shù)據(jù)分析發(fā)掘新的鼻咽癌免疫微環(huán)境預(yù)后分型模型及腫瘤細胞與免疫微環(huán)境細胞互作關(guān)系分析

最后，通過單細胞腫瘤細胞-免疫微環(huán)境互作分析，研究人員意外地發(fā)現(xiàn)“上皮-免疫”雙重特征腫瘤細胞亞群對于免疫微環(huán)境中的T細胞存在更強的免疫抑制和調(diào)控功能。流式細胞實驗分析證實了鼻咽癌免疫微環(huán)境中表達共抑制分子受體的浸潤T細胞比例與“上皮-免疫”雙重特征腫瘤細胞存在正相關(guān)性。進一步的共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)雙重特征腫瘤細胞具有抑制CD8+ TILs分泌IFN-γ能力，這可能是造成腫瘤浸潤T細胞耗竭的重要原因（圖5）。

圖5，“上皮-免疫”雙重特征腫瘤細胞對于T細胞具有明顯的抑制和調(diào)控功能

綜上，該研究在單細胞水平全面呈現(xiàn)了鼻咽癌腫瘤微環(huán)境細胞組分和EBV表達圖譜，同時解析了腫瘤細胞、EBV和TME非腫瘤細胞之間的互作關(guān)系，為研究NPC提供了很好的參考。特別是，本研究發(fā)現(xiàn)的“上皮-免疫”雙重特征腫瘤細胞亞群，拓展了對于腫瘤細胞表型變化的全新認識。

北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心金善釗博士（已畢業(yè)）、博士后李若巖（現(xiàn)工作于英國Sanger Institute）和尉超（現(xiàn)工作于上海巴斯德研究所），中山大學腫瘤防治中心陳明遠教授、唐林泉副主任醫(yī)師為本文并列第一作者。中山大學腫瘤防治中心曾木圣教授、鐘茜副研究員，以及北京大學生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新中心白凡研究員為本文共同通訊作者。哈佛醫(yī)學院Brigham婦女醫(yī)院Bo Zhao教授，Benjamin E. Gewurz教授，以及英國華威大學華威醫(yī)學院Lawrence S. Young教授為本研究提供了重要指導。該研究項目同時得到了國家重點研發(fā)計劃、國家科技重大專項、國家自然科學基金、廣東省重點研發(fā)項目，以及廣東省自然科學基金等的支持。

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