北京大學化學學院長江特聘教授，國家杰出青年基金獲得者、教育部長江學者特聘教授。分別于 1984、1987、1989 年在北京大學獲學士、碩士、博士學位，1998—1999 年在美國加州 Berkeley大學任 Berkeley 學者。曾獲求是基金會杰出青年科學家獎、中國化學會計算機化學杰出貢獻獎等。擔任 BMCBioinformatics 副主編，J Med Chem、J Mol Recog、Quantitative Biology、《物理化學學報》等雜志編委或顧問編委。主要從事基于結構與系統生物學的藥物設計方法與應用、蛋白質設計、蛋白質別構及無序蛋白質調控、腫瘤細胞代謝和炎癥網絡調控機制研究等。發表研究論文 300 余篇，獲得軟件知識產權及專利 30 余項。

北京大學化學學院副教授。1984、1987 年在蘭州大學分獲學士、碩士學位，1999 年在南開大學獲得博士學位， 1999—2001 年在北京大學從事博士后研究，出站后在北京大學任職，是來魯華教授研究團隊的成員。主要從事與生命活動相關的蛋白質與配基小分子的相互作用研究，發表論文 70 余篇，獲得專利 10 余項。

劉培¹ ，王立銘 ¹ ，劉瑩 ^1,2* ，來魯華 ^1,2,3**

（1. 北京大學化學與分子工程學院分子動態與穩態結構國家重點實驗室北京分子科學國家研究中心，北京 100871；2. 北京大學定量生物學中心，北京 100871；3. 北京大學-清華生命科學聯合中心，北京 100871）

[摘要] 別構藥物具有高選擇性和抗耐藥性的優勢。相對于正構藥物較為成熟的研究策略，目前別構調控分子的發現存在很大挑戰。總結筆者實驗室在別構調控研究領域取得的進展，包括別構位點的理論計算預測方法、別構調控分子理性設計的成功示例，并討論了別構藥物研發領域面臨的挑戰以及新的發展動向。

別構（又稱“變構”）調控（allosteric regulation）是指效應分子結合在蛋白質三維結構上不同于底物位點的別構位點（allosteric site），通過多種信號傳導途徑而導致蛋白質活性改變的過程。作為一種細胞內有效的調控蛋白質功能的方式，別構調控在很多的生物過程中發揮著重要作用，包括酶催化、信號傳導、轉錄調控 、代謝調控、協同進化等。自 50 多年前提出別構效應以來，除了別構調控的詳細機制尚未研究清楚，別構概念、實驗和理論研究都有很大進展。

別構調控在蛋白質中廣泛存在，因此針對別構位點進行藥物設計為控制蛋白質活性提供了另外一條途徑。藥物根據其作用機制可以分為正構藥物（orthosteric drug）和別構藥物（allosteric drug）。正構藥物結合在蛋白質的活性位點，占據底物或輔基的結合位點，通過阻礙底物或者輔基與蛋白質的結合而抑制蛋白質的活性；別構藥物則通過結合在非活性位點來改變或者阻斷催化或者底物的結合來發揮作用。目前除了在美國上市的 18 種別構調控劑，大部分已上市藥物為正構藥物。相對于正構藥物，別構藥物有著如下優勢：1）選擇性高。正構位點藥物，由于其同家族蛋白活性位點的保守性，存在選擇性的問題；別構藥物則由于結合位點的結構保守性低，因而副作用更小。2）別構藥物和底物可以同時發揮作用，其調控功能具有上限性，毒性小。3）別構位點提供了新的結合位點。從功能上講，別構藥物既可以下調蛋白的活性成為抑制劑，也可以上調蛋白活性成為激活劑。目前已有多種針對不同靶標的別構調控分子被發現，包括 G 蛋白偶聯受體、離子通道、酶以及其他的靶標，然而大部分別構調控分子還是通過高通量實驗篩選獲得，別構調控分子的理性設計和發現仍頗具挑戰性。

近年來有關別構調控分子的理性設計和發現取得了令人鼓舞的成果，詳見近期綜述。筆者實驗室對于別構調控的研究源于對于人類花生四烯酸（AA）代謝網絡調控的研究，為了有效控制炎性分子的產生，需要上調網絡中的一些靶標，而酶的激活只能通過別構調控來實現 ，筆者實驗室發展了別構位點預測方法和別構調控分子的理性設計方法，并在一些重要靶標上獲得了上調的別構分子。本文將主要介紹別構位點的預測與確認，以及別構調控分子的發現實例。

1 基于理論計算的別構位點發現

理性設計別構調控分子，首先需要尋找靶標的別構位點（見圖 1）。雖然原則上所有的蛋白質都是別構的，但是被實驗確認的別構位點數量有限，目前最大的別構蛋白數據庫（allosteric database，ASD）也只收錄了 1 949 個蛋白質。近十幾年來，很多研究者也一直在關注如何發現潛在的別構口袋。發現別構口袋的方法可以分為實驗（包括高通量篩選、點突變、核磁馳豫擴散實驗和氘氫交換質譜等）和理論計算兩大類。單純開展實驗工作的研究，一方面工作量很大，另一方面實驗發現具有偶然性；而理論計算方法在降低成本的同時可以大幅提高別構位點發現的成功率，有利于別構抑制劑的機制的探究，因此，需要發展基于理論計算的別構位點預測方法。

當已知蛋白質活性和非活性 2 種狀態的結構時，可以根據這 2 種結構的轉變情況進行別構位點預測。Qi 等和 Ma 等發展了利用粗粒化二態Gō 模型預測蛋白質別構口袋的方法。首先用二態Gō 產生蛋白質活性構象和非活性構象的平衡系綜，然后在探測到的蛋白質表面可成藥結合位點（非活性位點）內，用微擾的方法改變殘基之間的相互作用模擬小分子的結合過程。若微擾的施加導致蛋白質構象系綜發生變化，那么此微擾施加的位點便可能是一個潛在的別構位點。利用這種方法，結合筆者實驗室發展的口袋探測程序 CAVITY ，成功發現了大腸埃希菌中 D-3- 磷酸甘油酸脫氫酶（E.coli D-3-phosphoglycerate dehydrogenase，PGDH） 的 新的別構位點，并在此基礎上經計算虛擬篩選和實驗獲得了別構抑制劑。這種預測蛋白質別構口袋的方法需要已知所研究蛋白質的 2 種構象及活性有差別的狀態，故其應用范圍有局限性。

大多數情況下并不知道所研究的蛋白質是否會被別構調控，更沒有調控后的結構數據可用。針對這種情況，Ma 等假設蛋白質正構位點和別構位點運動上的強相關性是一種普遍存在的現象，可用于別構位點預測，并采用粗粒化的高斯網絡模型對這種相關性進行了研究。他們在測試 23 個聚集狀態為單體的別構蛋白質的 24 個已知別構口袋后發現，其中 23 個已知別構口袋與其對應的正構口袋在運動上顯示了強相關性。隨后他們又分析了幾種多聚體別構蛋白質，發現其正構口袋與別構口袋也有很強的相關性。并且這種結果不依賴于蛋白質的初始結構，具有魯棒性。基于這些結果開發了一種在已知一種蛋白質構象的情況下，可以快速預測蛋白質別構口袋的理論計算方法和程序 CorrSite。

為方便用戶使用，以上的程序 CAVITY 和CorrSite 已集成在 CavityPlus 上。CavityPlus 是一個 Web 在線計算平臺，使用蛋白質三維結構信息作為輸入，提供蛋白質口袋檢測和各種功能分析。該平臺應用 CAVITY 來檢測給定蛋白質結構表面上的潛在結合位點，并根據配體性和可成藥性評分對其進行排名。可以使用 3 個子模塊 CavPharmer 、CorrSite 和 CovCys 進一步分析這些潛在的結合位點：CavPharmer 使用基于受體的藥效團建模程序 Pocket 以自動提取口袋內的藥效團特征；CorrSite可以識別潛在的別構配體結合位點；CovCys 則能自動檢測可藥用的半胱氨酸殘基，可在設計共價別構分子時用于尋找合適的共價結合位點。

其他研究團隊也通過不同計算策略開發出多種類型的別構位點預測方法。在這些預測方法中，筆者實驗室開發的 CorrSite 表現出其優越性：與基于二態 Gō 模型預測別構口袋的方法相比，CorrSite 只需蛋白質任意一種活性狀態的結構即可，使用范圍更廣；與利用分子動力學（moleculardynamics，MD） 模擬來預測別構口袋的方法相比，CorrSite 耗時很短，使用方便；與僅基于結構的方法相比，CorrSite 考慮到蛋白質結構中各個部分的相互作用；與同樣使用正則模式分析（normal mode analysis，NMA）來鑒定蛋白質別構位點的 PARS（Protein Allosteric and Regulatory Sites）方法相比，CorrSite 的算法更為簡單，正確率也更高。不過，受限于當時可用的蛋白數量以及計算量，CorrSite存在一定的局限性，這也是進行別構位點預測研究遇到的共性的問題。隨著已知別構蛋白質復合物結構數量的增加，CorrSite 可以在更大的數據集上進行驗證和優化。

目前，基于蛋白質動力學的別構位點研究受到很多關注，例如結合口袋特征及 NMA 分析進行蛋白質別構位點預測的方法 AllositePro 表現出較好的預測效果；Yu 等研究了計算原子運動相關性時的角度問題；Zhang 等在 2019 年發表的一篇綜述中提出蛋白質在進化過程中利用蛋白質內在動力學來調控別構與正構功能。基于蛋白質動力學相關性的別構位點預測方法，在多個體系的別構調控分子設計中得到了成功應用。

2 別構調控分子的理性設計實例

在找到靶標的別構位點之后，通過計算與實驗驗證相結合的方法有望發現別構調控分子。下面介紹筆者實驗室近年的研究進展。

2.1 別構激活劑的發現

與抑制劑的發現相比，蛋白質激活劑的發現更加困難，難點一在于很難通過計算預測別構分子與靶蛋白結合后起上調或下調的作用；難點二在于激活劑往往使得蛋白質處于能量較高、更加動態的活性構象，因此不能穩定在單一構象的狀態，這使得激活劑與靶蛋白的復合物晶體結構解析更為困難。目前，發現激活劑的主要途徑依舊是高通量篩選，也有一些理性設計激活劑的例子被報道，如 SIRT6激活劑的發現等，尚無普遍適用的開發激活劑的方法。

2.1.1 磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶激活劑 磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase 4，GPx4），是一個含有硒的谷胱甘肽過氧化物酶。GPx4 與細胞膜修復、炎癥及鐵死亡抑制等諸多生物調控過程相關 。上調 GPx4 的活性對于炎癥以及鐵死亡相關的疾病治療有益。因此，開發GPx4 激活劑對于相關的疾病治療具有重要意義。

Li 等使用 CorrSite 和 CAVITY 在 GPx4的三維結構上成功發現了一個新的別構位點（見圖2A）。預測的別構位點 Cavity 打分最高且 CorrSite得分為 1.5（CorrSite 方法中通常將 CorrSite 得分大于 0.5 的口袋預測為潛在的別構位點）。該別構位點處于底物位點的背面，由 3 個酸性殘基（Asp21、Asp23 和 Asp101）、2 個 堿 性 殘 基（Lys31 和Lys90）和 7 個非極性殘基（Ile22、Ala93、Ala94、Val98、Phe100、Met102 和 Phe103） 包 圍。通過對 SPECS 化合物庫進行計算虛擬篩選挑選后購買的 251 個化合物進行酶活測試，最終得到激活劑分子 PKUMDL-LC-001（1）。化合物 1 以劑量依賴性方式將人源 GPx4 的 U46C 突變體（human GPx4 U46C mutant，hGPx4-C）的酶活性提高到原始酶活性的 263%，其與 hGPx4-C 的平衡解離常數（K D ）為（63±5）mol · L ^-1 。對該化合物進行結構修飾后，得到活性提高的化合物 1d4（2，見圖 2B），其達到 150% 激活所需的濃度為 20 mol · L ^-1 。突變實驗中，將別構口袋中的關鍵氨基酸 Asp21 和 Asp23 突變后測試發現，化合物 1 和 2 對 2 個單突變（D21A和 D23A）和 1 個雙突變（D21A/D23A）激活活性降低，證實化合物 1 和 2 結合在所預測的別構位點上（見圖 2C）；敲除 GPx4 后，化合物 1 和 2 對于細胞提取物的激活效果消失，證明其在細胞中的特異性。化合物 1 對于鐵死亡的抑制、對于 AA 代謝網絡中炎癥前脂質中間體的抑制以及對于核因子 κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路的抑制均進一步證實其作用于 GPx4。

2.1.2 15-脂氧合酶激活劑 人網狀細胞 15-脂氧合酶（15-lipoxygenase，15-LOX）是相對分子質量為75 000 的脂肪酸雙加氧酶，其產物 15-羥基二十碳四烯酸（15-HETE）可以進一步轉換為具有抗炎活性和消炎能力的脂蛋白（lipoxins，LXs） 。上調15-LOX 可以促進抗炎因子生成且同時減少促炎因子 ，是潛在的治療炎癥相關疾病的靶點。另外，15-LOX 與癌癥和鐵死亡密切相關。因此，針對 15-LOX 設計的激活劑，既能夠作為分子探針工具研究其功能也能夠開發為治療相關疾病的藥物。

Meng 等應用 MutInf 方法尋找與 15-LOX 底物結合位點二面角運動相關性高的殘基，并結合CAVITY 判斷這些殘基是否適于形成可成藥口袋，成功地在 15-LOX 底物口袋附近找到一個新的別構位點 cavity 1。隨后，筆者實驗室使用 CorrSite 對15-LOX 所有的潛在別構口袋進行了預測，cavity 1的 CorrSite 得分為 1.1，排名第三。與 MutInf 方法相比，CorrSite 方法耗時少且使用方便。

筆者實驗室通過對 cavity 1 使用 SPECS 化合物庫進行計算虛擬篩選和實驗研究，得到 1 個激活劑和 11個抑制劑分子，其中激活劑分子 PKUMDL_MH_1001（3）的半數激活常數（AC 50 ）為（6.8± 0.4） mol · L ^-1 ，K D 為（3.9±0.1）mol · L ^-1 。虛擬篩選后對化合物進行活性測試，獲得了另外 2 個激活劑分子。將激活劑與抑制劑化合物的結構進行比對后發現，激活劑分子中均包含可以與帶負電殘基形成強氫鍵的正電性基團。隨后，筆者實驗室對 15-LOX 的別構激活及抑制機制進行了研究，發現激活劑與 Asp277 形成氫鍵后可以穩定 15-LOX 活性構象，減少底物自抑制的作用；而抑制劑傾向于使活性位點口袋的“開合運動”受到阻礙。突變實驗表明化合物 3 對于15-LOX 的突變體 R242A 和 D277A 的激活活性大幅下降，驗證了化合物3結合在所預測的別構位點（見圖 3）。此外，在人的中性粒細胞、人全血和小鼠腹膜炎模型中，化合物 3 不僅增加了 15-LOX 的產物 15-HETE 水平，還減少了促炎性介質的產生。更有意義的是，化合物 3 與 5-LOX 或 COX 抑制劑的聯合使用可平衡 AA 代謝網絡中的不同途徑，這為阻斷炎癥的新策略提供了依據。

2.2 別構抑制劑的發現

2.2.1 D-3-磷酸甘油酸脫氫酶別構抑制劑 D-3-磷酸甘油酸脫氫酶（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）催化生物體內合成絲氨酸的第一步反應，是絲氨酸合成的決速步驟。PHGDH 在癌癥的發展中起著重要作用；PHGDH 的基因敲除或使用PHGDH 的小分子抑制劑都會大幅抑制對 PHGDH敏感的細胞在體內或體外的生長，對 PHGDH 不敏感的細胞系受到的影響則較小。靶向 PHGDH 的抑制劑有著廣泛的應用前景。由于 PHGDH 的底物口袋小，輔基NAD + 在細胞中的濃度達到毫摩爾級，正構位點的抑制劑面臨選擇性差而無體內活性的問題。因此，針對 PHGDH 設計別構抑制劑是一種有效的策略。

考慮到 PHGDH 的全長結構尚未解出，Wang等利用現有的僅包含 2 個結構域的晶體結構（Pdb code：2g76）使用 CAVITY 程序進行了別構口袋的預測，并獲得了 2 個別構口袋（位點Ⅰ和位點Ⅱ，見圖 4）。位點Ⅰ靠近活性位點和 NAD + /NADH 輔因子結合位點，位點Ⅱ靠近底物結合域。隨后，筆者實驗室對 SPECS 化合物庫進行了計算虛擬篩選，得到 1 個結合在位點Ⅰ的化合物 PKUMDL-WQ-2101（4）和 3 個結合在位點Ⅱ的化合物：PKUMDL-WQ-2201（5）、PKUMDL-WQ-2202、PKUMDL-WQ-2203。其中活性最好的化合物 4 和 5對 PHGDH 的 IC 50 為（34.8±3.6） 和（35.7±8.6 ）mol · L^-1 ，二者與 PHGDH 的 K D 分別為（0.56±0.10）和（66.9±1.9） mol · L ^-1。突變實驗中，化合物 4 對于突變位置在別構位點Ⅰ的 PHGDH 突變體 R134A和 K57AT59A，化合物 5 對于對于突變位置在別構位點Ⅱ的 PHGDH 突變體 T59A 和 T56AK57A 的抑制活性均大幅降低，驗證了化合物 4 和 5 分別結合在別構位點Ⅰ和位點Ⅱ。在細胞實驗中，化合物4 和 5 對 PHGDH 敏感性細胞系 MDA-MB-468 的EC 50 分別為 7.7 和 6.9 mol · L ^-1 ，同時對 PHGDH 不敏感性細胞系呈現出很好的選擇性，表明在細胞中化合物 4 和 5 靶向作用于 PHGDH。研究發現，這2 個化合物在 PHGDH 敲除后的細胞中均無特異性活性；二者還減少了絲氨酸合成通路及其下游通路的代謝產物的量，與PHGDH基因敲除的影響類似。此外，二者在動物實驗中也展現出了對于腫瘤組織的抑制效果。

2.2.2 保羅樣激酶 1 的非 ATP 競爭型抑制劑 保羅樣激酶 1（Polo-like kinase 1，PLK1）是哺乳動物細胞中參與多步有絲分裂的賴氨酸/蘇氨酸激酶，其結構包括識別底物的調控結構域（Polo-box domain，PBD）和催化底物的激酶結構域（kinase domain，KD）。研究表明人源 PLK1 在多種惡性腫瘤中過表達 ，抑制 PLK1 可以抑制癌細胞的生長，因此，PLK1 被認為是一個潛在的抗腫瘤靶標。已有的 PLK1 抑制劑主要作用于 KD 的 ATP 結合口袋，是 ATP 競爭型抑制劑。該類抑制劑活性高但選擇性低，作為藥物使用產生的不良反應較多，而非 ATP競爭型抑制劑能夠提高選擇性以及延緩突變。

Yun 等使用 CAVITY 對 PLK1 晶體結構進行了可成藥性口袋分析計算，在 ATP 結合位點的附近發現了全新的別構口袋（見圖 5A）。通過對別構口袋中的位點Ⅱ進行虛擬篩選并進行 PLK1 體外酶活性測試，發現了多個活性化合物。其中活性最好的化合物 6 對全長 PLK1 酶活的 IC 50 為（13.1± 1.7）mol · L ^-1，與 ATP 沒有競爭性結合（見圖 5B）。

3 結論和展望

筆者實驗室開發了預測別構位點的方法，預測了 GPx4、15-LOX、PHGDH 和 PLK1 中的別構位點，并分別針對這些位點成功發現了別構調控分子。

在過去的幾十年里，基于結構的藥物設計大大加速了藥物發現的進程。別構藥物相對于正構藥物所具有的高選擇性和抗耐藥性受到很多關注。越來越多的別構藥物正被發現，別構藥物涉及的靶標也從最初的 G 蛋白偶聯受體和激酶擴展到現在的 14種蛋白類別，也有不少別構調控分子被發現。盡管有這些成功的例子，但是基于結構的別構藥物設計依然具有很大的挑戰性。主要在于以下 3 個方面：

1）別構位點的預測。其一，目前有很多方法和軟件用于別構位點預測，但因已知的適合用來訓練和測試的別構蛋白的樣本數量及計算量有限，這些預測方法本身的精度及適用性存在差異，還需要其他更多的研究來證明其有效性。其二，選擇什么樣的構象開始進行預測是研究人員在進行別構藥物設計時遇到的首要問題。最近，張健研究組發現，當蛋白質中正構和變構位點之間的距離小于 5 ? 時，選擇結合底物的蛋白構象作為基于結構的變構藥物篩選的初始輸入，有助于發現變構藥物。本文介紹的例子中，2 個例子（PHGDH 和 PLK1）使用結合底物的蛋白構象作為初始輸入，而預測得到的別構位點都在活性位點附近，支持了此結論。其三，在別構藥物設計中，有些別構口袋在 apo（不結合別構藥物的構象）狀態時不存在（hidden allosteric site），這種情況下可能需要進行大規模分子動力學模擬，結合馬爾科夫狀態模型（Markov state model）以獲得潛在的別構位點。

2）別構藥物的優化（hit-to-lead optimization）。首先，別構藥物的活性往往低于正構藥物。由于別構藥物的活性與其親和力并無直接關系，用傳統的方法對別構藥物優化時，雖然可以提升藥物分子的親和力，但并不一定提升活性，因此產生“flat SAR”或者“limited SAR”的現象。其次，別構調控分子細微的差別即可能導致發揮的功能不同，理解別構分子的機制對于別構藥物優化非常重要。例如，筆者實驗室的 Bi 等在大腸埃希菌趨化研究中發現的化學效應分子（chemo effectors）類似物CHDCA 和 cis-PDA，二者分別是大腸埃希菌 Tar 受體的拮抗劑（antagonist）和引誘劑（attractant），其結構差別只是后者多了一個 N - H 基團，通過與Tar 受體的相互作用比較發現，引誘劑都是在合適的位置（靠近 Tyr149 和 Gln152）有 1 個氫鍵供體基團作為信號的觸發基團。因此，別構調控分子發揮的作用可以分為兩部分：一部分用于與受體結合；另一部分起到信號觸發（trigger）的作用。類似的情況也在 15-LOX 激活劑的介紹部分提到過，即當結合在別構位點的分子沒有帶正電時成為抑制劑，而當帶正電時就成為激活劑。綜上，別構分子的優化復雜且富有挑戰性。

3）相對于正構位點，別構位點的成藥性往往更差，別構位點計算虛擬篩選的成功率也遠低于正構位點，從而限制了別構藥物的多樣性。

別構藥物的發展面臨著種種挑戰，但是其在一些新的方向越來越受到關注。比如，開發別構共價藥物，可以保留別構藥物的優勢，同時也可以增加藥物-靶標配體的半衰期從而降低毒性。筆者實驗室所開發的 CovCys 程序可以探測蛋白質中能夠形成共價的半胱氨酸，該程序也已集成在CavityPlus 中供直接使用。另外，在開發別構藥物對于蛋白-蛋白相互作用界面的調控，不可成藥靶標的調控，通過別構研究老藥新用以及理解中草藥在治療復雜疾病時所發揮的作用等方面也有進展。從系統生物學及別構網絡（allo-network）的角度進行別構藥物的設計將會影響未來的藥物發現和發展。

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