北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院長(zhǎng)江特聘教授，國(guó)家杰出青年基金獲得者、教育部長(zhǎng)江學(xué)者特聘教授。分別于 1984、1987、1989 年在北京大學(xué)獲學(xué)士、碩士、博士學(xué)位，1998—1999 年在美國(guó)加州 Berkeley大學(xué)任 Berkeley 學(xué)者。曾獲求是基金會(huì)杰出青年科學(xué)家獎(jiǎng)、中國(guó)化學(xué)會(huì)計(jì)算機(jī)化學(xué)杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)等。擔(dān)任 BMCBioinformatics 副主編，J Med Chem、J Mol Recog、Quantitative Biology、《物理化學(xué)學(xué)報(bào)》等雜志編委或顧問(wèn)編委。主要從事基于結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)生物學(xué)的藥物設(shè)計(jì)方法與應(yīng)用、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)、蛋白質(zhì)別構(gòu)及無(wú)序蛋白質(zhì)調(diào)控、腫瘤細(xì)胞代謝和炎癥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制研究等。發(fā)表研究論文 300 余篇，獲得軟件知識(shí)產(chǎn)權(quán)及專(zhuān)利 30 余項(xiàng)。

北京大學(xué)化學(xué)學(xué)院副教授。1984、1987 年在蘭州大學(xué)分獲學(xué)士、碩士學(xué)位，1999 年在南開(kāi)大學(xué)獲得博士學(xué)位， 1999—2001 年在北京大學(xué)從事博士后研究，出站后在北京大學(xué)任職，是來(lái)魯華教授研究團(tuán)隊(duì)的成員。主要從事與生命活動(dòng)相關(guān)的蛋白質(zhì)與配基小分子的相互作用研究，發(fā)表論文 70 余篇，獲得專(zhuān)利 10 余項(xiàng)。

劉培¹ ，王立銘 ¹ ，劉瑩 ^1,2* ，來(lái)魯華 ^1,2,3**

（1. 北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院分子動(dòng)態(tài)與穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心，北京 100871；2. 北京大學(xué)定量生物學(xué)中心，北京 100871；3. 北京大學(xué)-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心，北京 100871）

[摘要] 別構(gòu)藥物具有高選擇性和抗耐藥性的優(yōu)勢(shì)。相對(duì)于正構(gòu)藥物較為成熟的研究策略，目前別構(gòu)調(diào)控分子的發(fā)現(xiàn)存在很大挑戰(zhàn)。總結(jié)筆者實(shí)驗(yàn)室在別構(gòu)調(diào)控研究領(lǐng)域取得的進(jìn)展，包括別構(gòu)位點(diǎn)的理論計(jì)算預(yù)測(cè)方法、別構(gòu)調(diào)控分子理性設(shè)計(jì)的成功示例，并討論了別構(gòu)藥物研發(fā)領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)以及新的發(fā)展動(dòng)向。

別構(gòu)（又稱(chēng)“變構(gòu)”）調(diào)控（allosteric regulation）是指效應(yīng)分子結(jié)合在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上不同于底物位點(diǎn)的別構(gòu)位點(diǎn)（allosteric site），通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑而導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性改變的過(guò)程。作為一種細(xì)胞內(nèi)有效的調(diào)控蛋白質(zhì)功能的方式，別構(gòu)調(diào)控在很多的生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括酶催化、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控 、代謝調(diào)控、協(xié)同進(jìn)化等。自 50 多年前提出別構(gòu)效應(yīng)以來(lái)，除了別構(gòu)調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制尚未研究清楚，別構(gòu)概念、實(shí)驗(yàn)和理論研究都有很大進(jìn)展。

別構(gòu)調(diào)控在蛋白質(zhì)中廣泛存在，因此針對(duì)別構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)為控制蛋白質(zhì)活性提供了另外一條途徑。藥物根據(jù)其作用機(jī)制可以分為正構(gòu)藥物（orthosteric drug）和別構(gòu)藥物（allosteric drug）。正構(gòu)藥物結(jié)合在蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)，占據(jù)底物或輔基的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)阻礙底物或者輔基與蛋白質(zhì)的結(jié)合而抑制蛋白質(zhì)的活性；別構(gòu)藥物則通過(guò)結(jié)合在非活性位點(diǎn)來(lái)改變或者阻斷催化或者底物的結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用。目前除了在美國(guó)上市的 18 種別構(gòu)調(diào)控劑，大部分已上市藥物為正構(gòu)藥物。相對(duì)于正構(gòu)藥物，別構(gòu)藥物有著如下優(yōu)勢(shì)：1）選擇性高。正構(gòu)位點(diǎn)藥物，由于其同家族蛋白活性位點(diǎn)的保守性，存在選擇性的問(wèn)題；別構(gòu)藥物則由于結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)保守性低，因而副作用更小。2）別構(gòu)藥物和底物可以同時(shí)發(fā)揮作用，其調(diào)控功能具有上限性，毒性小。3）別構(gòu)位點(diǎn)提供了新的結(jié)合位點(diǎn)。從功能上講，別構(gòu)藥物既可以下調(diào)蛋白的活性成為抑制劑，也可以上調(diào)蛋白活性成為激活劑。目前已有多種針對(duì)不同靶標(biāo)的別構(gòu)調(diào)控分子被發(fā)現(xiàn)，包括 G 蛋白偶聯(lián)受體、離子通道、酶以及其他的靶標(biāo)，然而大部分別構(gòu)調(diào)控分子還是通過(guò)高通量實(shí)驗(yàn)篩選獲得，別構(gòu)調(diào)控分子的理性設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)仍頗具挑戰(zhàn)性。

近年來(lái)有關(guān)別構(gòu)調(diào)控分子的理性設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)取得了令人鼓舞的成果，詳見(jiàn)近期綜述。筆者實(shí)驗(yàn)室對(duì)于別構(gòu)調(diào)控的研究源于對(duì)于人類(lèi)花生四烯酸（AA）代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的研究，為了有效控制炎性分子的產(chǎn)生，需要上調(diào)網(wǎng)絡(luò)中的一些靶標(biāo)，而酶的激活只能通過(guò)別構(gòu)調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn) ，筆者實(shí)驗(yàn)室發(fā)展了別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法和別構(gòu)調(diào)控分子的理性設(shè)計(jì)方法，并在一些重要靶標(biāo)上獲得了上調(diào)的別構(gòu)分子。本文將主要介紹別構(gòu)位點(diǎn)的預(yù)測(cè)與確認(rèn)，以及別構(gòu)調(diào)控分子的發(fā)現(xiàn)實(shí)例。

1 基于理論計(jì)算的別構(gòu)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)

理性設(shè)計(jì)別構(gòu)調(diào)控分子，首先需要尋找靶標(biāo)的別構(gòu)位點(diǎn)（見(jiàn)圖 1）。雖然原則上所有的蛋白質(zhì)都是別構(gòu)的，但是被實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的別構(gòu)位點(diǎn)數(shù)量有限，目前最大的別構(gòu)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（allosteric database，ASD）也只收錄了 1 949 個(gè)蛋白質(zhì)。近十幾年來(lái)，很多研究者也一直在關(guān)注如何發(fā)現(xiàn)潛在的別構(gòu)口袋。發(fā)現(xiàn)別構(gòu)口袋的方法可以分為實(shí)驗(yàn)（包括高通量篩選、點(diǎn)突變、核磁馳豫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和氘氫交換質(zhì)譜等）和理論計(jì)算兩大類(lèi)。單純開(kāi)展實(shí)驗(yàn)工作的研究，一方面工作量很大，另一方面實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有偶然性；而理論計(jì)算方法在降低成本的同時(shí)可以大幅提高別構(gòu)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的成功率，有利于別構(gòu)抑制劑的機(jī)制的探究，因此，需要發(fā)展基于理論計(jì)算的別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法。

當(dāng)已知蛋白質(zhì)活性和非活性 2 種狀態(tài)的結(jié)構(gòu)時(shí)，可以根據(jù)這 2 種結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變情況進(jìn)行別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)。Qi 等和 Ma 等發(fā)展了利用粗粒化二態(tài)Gō 模型預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)別構(gòu)口袋的方法。首先用二態(tài)Gō 產(chǎn)生蛋白質(zhì)活性構(gòu)象和非活性構(gòu)象的平衡系綜，然后在探測(cè)到的蛋白質(zhì)表面可成藥結(jié)合位點(diǎn)（非活性位點(diǎn)）內(nèi)，用微擾的方法改變殘基之間的相互作用模擬小分子的結(jié)合過(guò)程。若微擾的施加導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象系綜發(fā)生變化，那么此微擾施加的位點(diǎn)便可能是一個(gè)潛在的別構(gòu)位點(diǎn)。利用這種方法，結(jié)合筆者實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的口袋探測(cè)程序 CAVITY ，成功發(fā)現(xiàn)了大腸埃希菌中 D-3- 磷酸甘油酸脫氫酶（E.coli D-3-phosphoglycerate dehydrogenase，PGDH） 的 新的別構(gòu)位點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上經(jīng)計(jì)算虛擬篩選和實(shí)驗(yàn)獲得了別構(gòu)抑制劑。這種預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)別構(gòu)口袋的方法需要已知所研究蛋白質(zhì)的 2 種構(gòu)象及活性有差別的狀態(tài)，故其應(yīng)用范圍有局限性。

大多數(shù)情況下并不知道所研究的蛋白質(zhì)是否會(huì)被別構(gòu)調(diào)控，更沒(méi)有調(diào)控后的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可用。針對(duì)這種情況，Ma 等假設(shè)蛋白質(zhì)正構(gòu)位點(diǎn)和別構(gòu)位點(diǎn)運(yùn)動(dòng)上的強(qiáng)相關(guān)性是一種普遍存在的現(xiàn)象，可用于別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)，并采用粗粒化的高斯網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)這種相關(guān)性進(jìn)行了研究。他們?cè)跍y(cè)試 23 個(gè)聚集狀態(tài)為單體的別構(gòu)蛋白質(zhì)的 24 個(gè)已知?jiǎng)e構(gòu)口袋后發(fā)現(xiàn)，其中 23 個(gè)已知?jiǎng)e構(gòu)口袋與其對(duì)應(yīng)的正構(gòu)口袋在運(yùn)動(dòng)上顯示了強(qiáng)相關(guān)性。隨后他們又分析了幾種多聚體別構(gòu)蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其正構(gòu)口袋與別構(gòu)口袋也有很強(qiáng)的相關(guān)性。并且這種結(jié)果不依賴(lài)于蛋白質(zhì)的初始結(jié)構(gòu)，具有魯棒性。基于這些結(jié)果開(kāi)發(fā)了一種在已知一種蛋白質(zhì)構(gòu)象的情況下，可以快速預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)別構(gòu)口袋的理論計(jì)算方法和程序 CorrSite。

為方便用戶(hù)使用，以上的程序 CAVITY 和CorrSite 已集成在 CavityPlus 上。CavityPlus 是一個(gè) Web 在線計(jì)算平臺(tái)，使用蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)信息作為輸入，提供蛋白質(zhì)口袋檢測(cè)和各種功能分析。該平臺(tái)應(yīng)用 CAVITY 來(lái)檢測(cè)給定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)表面上的潛在結(jié)合位點(diǎn)，并根據(jù)配體性和可成藥性評(píng)分對(duì)其進(jìn)行排名。可以使用 3 個(gè)子模塊 CavPharmer 、CorrSite 和 CovCys 進(jìn)一步分析這些潛在的結(jié)合位點(diǎn)：CavPharmer 使用基于受體的藥效團(tuán)建模程序 Pocket 以自動(dòng)提取口袋內(nèi)的藥效團(tuán)特征；CorrSite可以識(shí)別潛在的別構(gòu)配體結(jié)合位點(diǎn)；CovCys 則能自動(dòng)檢測(cè)可藥用的半胱氨酸殘基，可在設(shè)計(jì)共價(jià)別構(gòu)分子時(shí)用于尋找合適的共價(jià)結(jié)合位點(diǎn)。

其他研究團(tuán)隊(duì)也通過(guò)不同計(jì)算策略開(kāi)發(fā)出多種類(lèi)型的別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法。在這些預(yù)測(cè)方法中，筆者實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的 CorrSite 表現(xiàn)出其優(yōu)越性：與基于二態(tài) Gō 模型預(yù)測(cè)別構(gòu)口袋的方法相比，CorrSite 只需蛋白質(zhì)任意一種活性狀態(tài)的結(jié)構(gòu)即可，使用范圍更廣；與利用分子動(dòng)力學(xué)（moleculardynamics，MD） 模擬來(lái)預(yù)測(cè)別構(gòu)口袋的方法相比，CorrSite 耗時(shí)很短，使用方便；與僅基于結(jié)構(gòu)的方法相比，CorrSite 考慮到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中各個(gè)部分的相互作用；與同樣使用正則模式分析（normal mode analysis，NMA）來(lái)鑒定蛋白質(zhì)別構(gòu)位點(diǎn)的 PARS（Protein Allosteric and Regulatory Sites）方法相比，CorrSite 的算法更為簡(jiǎn)單，正確率也更高。不過(guò)，受限于當(dāng)時(shí)可用的蛋白數(shù)量以及計(jì)算量，CorrSite存在一定的局限性，這也是進(jìn)行別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)研究遇到的共性的問(wèn)題。隨著已知?jiǎng)e構(gòu)蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)數(shù)量的增加，CorrSite 可以在更大的數(shù)據(jù)集上進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化。

目前，基于蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的別構(gòu)位點(diǎn)研究受到很多關(guān)注，例如結(jié)合口袋特征及 NMA 分析進(jìn)行蛋白質(zhì)別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)的方法 AllositePro 表現(xiàn)出較好的預(yù)測(cè)效果；Yu 等研究了計(jì)算原子運(yùn)動(dòng)相關(guān)性時(shí)的角度問(wèn)題；Zhang 等在 2019 年發(fā)表的一篇綜述中提出蛋白質(zhì)在進(jìn)化過(guò)程中利用蛋白質(zhì)內(nèi)在動(dòng)力學(xué)來(lái)調(diào)控別構(gòu)與正構(gòu)功能。基于蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)相關(guān)性的別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法，在多個(gè)體系的別構(gòu)調(diào)控分子設(shè)計(jì)中得到了成功應(yīng)用。

2 別構(gòu)調(diào)控分子的理性設(shè)計(jì)實(shí)例

在找到靶標(biāo)的別構(gòu)位點(diǎn)之后，通過(guò)計(jì)算與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法有望發(fā)現(xiàn)別構(gòu)調(diào)控分子。下面介紹筆者實(shí)驗(yàn)室近年的研究進(jìn)展。

2.1 別構(gòu)激活劑的發(fā)現(xiàn)

與抑制劑的發(fā)現(xiàn)相比，蛋白質(zhì)激活劑的發(fā)現(xiàn)更加困難，難點(diǎn)一在于很難通過(guò)計(jì)算預(yù)測(cè)別構(gòu)分子與靶蛋白結(jié)合后起上調(diào)或下調(diào)的作用；難點(diǎn)二在于激活劑往往使得蛋白質(zhì)處于能量較高、更加動(dòng)態(tài)的活性構(gòu)象，因此不能穩(wěn)定在單一構(gòu)象的狀態(tài)，這使得激活劑與靶蛋白的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)解析更為困難。目前，發(fā)現(xiàn)激活劑的主要途徑依舊是高通量篩選，也有一些理性設(shè)計(jì)激活劑的例子被報(bào)道，如 SIRT6激活劑的發(fā)現(xiàn)等，尚無(wú)普遍適用的開(kāi)發(fā)激活劑的方法。

2.1.1 磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶激活劑 磷脂氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase 4，GPx4），是一個(gè)含有硒的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶。GPx4 與細(xì)胞膜修復(fù)、炎癥及鐵死亡抑制等諸多生物調(diào)控過(guò)程相關(guān) 。上調(diào) GPx4 的活性對(duì)于炎癥以及鐵死亡相關(guān)的疾病治療有益。因此，開(kāi)發(fā)GPx4 激活劑對(duì)于相關(guān)的疾病治療具有重要意義。

Li 等使用 CorrSite 和 CAVITY 在 GPx4的三維結(jié)構(gòu)上成功發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的別構(gòu)位點(diǎn)（見(jiàn)圖2A）。預(yù)測(cè)的別構(gòu)位點(diǎn) Cavity 打分最高且 CorrSite得分為 1.5（CorrSite 方法中通常將 CorrSite 得分大于 0.5 的口袋預(yù)測(cè)為潛在的別構(gòu)位點(diǎn)）。該別構(gòu)位點(diǎn)處于底物位點(diǎn)的背面，由 3 個(gè)酸性殘基（Asp21、Asp23 和 Asp101）、2 個(gè) 堿 性 殘 基（Lys31 和Lys90）和 7 個(gè)非極性殘基（Ile22、Ala93、Ala94、Val98、Phe100、Met102 和 Phe103） 包 圍。通過(guò)對(duì) SPECS 化合物庫(kù)進(jìn)行計(jì)算虛擬篩選挑選后購(gòu)買(mǎi)的 251 個(gè)化合物進(jìn)行酶活測(cè)試，最終得到激活劑分子 PKUMDL-LC-001（1）。化合物 1 以劑量依賴(lài)性方式將人源 GPx4 的 U46C 突變體（human GPx4 U46C mutant，hGPx4-C）的酶活性提高到原始酶活性的 263%，其與 hGPx4-C 的平衡解離常數(shù)（K D ）為（63±5）mol · L ^-1 。對(duì)該化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，得到活性提高的化合物 1d4（2，見(jiàn)圖 2B），其達(dá)到 150% 激活所需的濃度為 20 mol · L ^-1 。突變實(shí)驗(yàn)中，將別構(gòu)口袋中的關(guān)鍵氨基酸 Asp21 和 Asp23 突變后測(cè)試發(fā)現(xiàn)，化合物 1 和 2 對(duì) 2 個(gè)單突變（D21A和 D23A）和 1 個(gè)雙突變（D21A/D23A）激活活性降低，證實(shí)化合物 1 和 2 結(jié)合在所預(yù)測(cè)的別構(gòu)位點(diǎn)上（見(jiàn)圖 2C）；敲除 GPx4 后，化合物 1 和 2 對(duì)于細(xì)胞提取物的激活效果消失，證明其在細(xì)胞中的特異性。化合物 1 對(duì)于鐵死亡的抑制、對(duì)于 AA 代謝網(wǎng)絡(luò)中炎癥前脂質(zhì)中間體的抑制以及對(duì)于核因子 κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）通路的抑制均進(jìn)一步證實(shí)其作用于 GPx4。

2.1.2 15-脂氧合酶激活劑 人網(wǎng)狀細(xì)胞 15-脂氧合酶（15-lipoxygenase，15-LOX）是相對(duì)分子質(zhì)量為75 000 的脂肪酸雙加氧酶，其產(chǎn)物 15-羥基二十碳四烯酸（15-HETE）可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為具有抗炎活性和消炎能力的脂蛋白（lipoxins，LXs） 。上調(diào)15-LOX 可以促進(jìn)抗炎因子生成且同時(shí)減少促炎因子 ，是潛在的治療炎癥相關(guān)疾病的靶點(diǎn)。另外，15-LOX 與癌癥和鐵死亡密切相關(guān)。因此，針對(duì) 15-LOX 設(shè)計(jì)的激活劑，既能夠作為分子探針工具研究其功能也能夠開(kāi)發(fā)為治療相關(guān)疾病的藥物。

Meng 等應(yīng)用 MutInf 方法尋找與 15-LOX 底物結(jié)合位點(diǎn)二面角運(yùn)動(dòng)相關(guān)性高的殘基，并結(jié)合CAVITY 判斷這些殘基是否適于形成可成藥口袋，成功地在 15-LOX 底物口袋附近找到一個(gè)新的別構(gòu)位點(diǎn) cavity 1。隨后，筆者實(shí)驗(yàn)室使用 CorrSite 對(duì)15-LOX 所有的潛在別構(gòu)口袋進(jìn)行了預(yù)測(cè)，cavity 1的 CorrSite 得分為 1.1，排名第三。與 MutInf 方法相比，CorrSite 方法耗時(shí)少且使用方便。

筆者實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì) cavity 1 使用 SPECS 化合物庫(kù)進(jìn)行計(jì)算虛擬篩選和實(shí)驗(yàn)研究，得到 1 個(gè)激活劑和 11個(gè)抑制劑分子，其中激活劑分子 PKUMDL_MH_1001（3）的半數(shù)激活常數(shù)（AC 50 ）為（6.8± 0.4） mol · L ^-1 ，K D 為（3.9±0.1）mol · L ^-1 。虛擬篩選后對(duì)化合物進(jìn)行活性測(cè)試，獲得了另外 2 個(gè)激活劑分子。將激活劑與抑制劑化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，激活劑分子中均包含可以與帶負(fù)電殘基形成強(qiáng)氫鍵的正電性基團(tuán)。隨后，筆者實(shí)驗(yàn)室對(duì) 15-LOX 的別構(gòu)激活及抑制機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)激活劑與 Asp277 形成氫鍵后可以穩(wěn)定 15-LOX 活性構(gòu)象，減少底物自抑制的作用；而抑制劑傾向于使活性位點(diǎn)口袋的“開(kāi)合運(yùn)動(dòng)”受到阻礙。突變實(shí)驗(yàn)表明化合物 3 對(duì)于15-LOX 的突變體 R242A 和 D277A 的激活活性大幅下降，驗(yàn)證了化合物3結(jié)合在所預(yù)測(cè)的別構(gòu)位點(diǎn)（見(jiàn)圖 3）。此外，在人的中性粒細(xì)胞、人全血和小鼠腹膜炎模型中，化合物 3 不僅增加了 15-LOX 的產(chǎn)物 15-HETE 水平，還減少了促炎性介質(zhì)的產(chǎn)生。更有意義的是，化合物 3 與 5-LOX 或 COX 抑制劑的聯(lián)合使用可平衡 AA 代謝網(wǎng)絡(luò)中的不同途徑，這為阻斷炎癥的新策略提供了依據(jù)。

2.2 別構(gòu)抑制劑的發(fā)現(xiàn)

2.2.1 D-3-磷酸甘油酸脫氫酶別構(gòu)抑制劑 D-3-磷酸甘油酸脫氫酶（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）催化生物體內(nèi)合成絲氨酸的第一步反應(yīng)，是絲氨酸合成的決速步驟。PHGDH 在癌癥的發(fā)展中起著重要作用；PHGDH 的基因敲除或使用PHGDH 的小分子抑制劑都會(huì)大幅抑制對(duì) PHGDH敏感的細(xì)胞在體內(nèi)或體外的生長(zhǎng)，對(duì) PHGDH 不敏感的細(xì)胞系受到的影響則較小。靶向 PHGDH 的抑制劑有著廣泛的應(yīng)用前景。由于 PHGDH 的底物口袋小，輔基NAD + 在細(xì)胞中的濃度達(dá)到毫摩爾級(jí)，正構(gòu)位點(diǎn)的抑制劑面臨選擇性差而無(wú)體內(nèi)活性的問(wèn)題。因此，針對(duì) PHGDH 設(shè)計(jì)別構(gòu)抑制劑是一種有效的策略。

考慮到 PHGDH 的全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)尚未解出，Wang等利用現(xiàn)有的僅包含 2 個(gè)結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（Pdb code：2g76）使用 CAVITY 程序進(jìn)行了別構(gòu)口袋的預(yù)測(cè)，并獲得了 2 個(gè)別構(gòu)口袋（位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ，見(jiàn)圖 4）。位點(diǎn)Ⅰ靠近活性位點(diǎn)和 NAD + /NADH 輔因子結(jié)合位點(diǎn)，位點(diǎn)Ⅱ靠近底物結(jié)合域。隨后，筆者實(shí)驗(yàn)室對(duì) SPECS 化合物庫(kù)進(jìn)行了計(jì)算虛擬篩選，得到 1 個(gè)結(jié)合在位點(diǎn)Ⅰ的化合物 PKUMDL-WQ-2101（4）和 3 個(gè)結(jié)合在位點(diǎn)Ⅱ的化合物：PKUMDL-WQ-2201（5）、PKUMDL-WQ-2202、PKUMDL-WQ-2203。其中活性最好的化合物 4 和 5對(duì) PHGDH 的 IC 50 為（34.8±3.6） 和（35.7±8.6 ）mol · L^-1 ，二者與 PHGDH 的 K D 分別為（0.56±0.10）和（66.9±1.9） mol · L ^-1。突變實(shí)驗(yàn)中，化合物 4 對(duì)于突變位置在別構(gòu)位點(diǎn)Ⅰ的 PHGDH 突變體 R134A和 K57AT59A，化合物 5 對(duì)于對(duì)于突變位置在別構(gòu)位點(diǎn)Ⅱ的 PHGDH 突變體 T59A 和 T56AK57A 的抑制活性均大幅降低，驗(yàn)證了化合物 4 和 5 分別結(jié)合在別構(gòu)位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，化合物4 和 5 對(duì) PHGDH 敏感性細(xì)胞系 MDA-MB-468 的EC 50 分別為 7.7 和 6.9 mol · L ^-1 ，同時(shí)對(duì) PHGDH 不敏感性細(xì)胞系呈現(xiàn)出很好的選擇性，表明在細(xì)胞中化合物 4 和 5 靶向作用于 PHGDH。研究發(fā)現(xiàn)，這2 個(gè)化合物在 PHGDH 敲除后的細(xì)胞中均無(wú)特異性活性；二者還減少了絲氨酸合成通路及其下游通路的代謝產(chǎn)物的量，與PHGDH基因敲除的影響類(lèi)似。此外，二者在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也展現(xiàn)出了對(duì)于腫瘤組織的抑制效果。

2.2.2 保羅樣激酶 1 的非 ATP 競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑 保羅樣激酶 1（Polo-like kinase 1，PLK1）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中參與多步有絲分裂的賴(lài)氨酸/蘇氨酸激酶，其結(jié)構(gòu)包括識(shí)別底物的調(diào)控結(jié)構(gòu)域（Polo-box domain，PBD）和催化底物的激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD）。研究表明人源 PLK1 在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá) ，抑制 PLK1 可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此，PLK1 被認(rèn)為是一個(gè)潛在的抗腫瘤靶標(biāo)。已有的 PLK1 抑制劑主要作用于 KD 的 ATP 結(jié)合口袋，是 ATP 競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑。該類(lèi)抑制劑活性高但選擇性低，作為藥物使用產(chǎn)生的不良反應(yīng)較多，而非 ATP競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑能夠提高選擇性以及延緩?fù)蛔?/span>。

Yun 等使用 CAVITY 對(duì) PLK1 晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了可成藥性口袋分析計(jì)算，在 ATP 結(jié)合位點(diǎn)的附近發(fā)現(xiàn)了全新的別構(gòu)口袋（見(jiàn)圖 5A）。通過(guò)對(duì)別構(gòu)口袋中的位點(diǎn)Ⅱ進(jìn)行虛擬篩選并進(jìn)行 PLK1 體外酶活性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)活性化合物。其中活性最好的化合物 6 對(duì)全長(zhǎng) PLK1 酶活的 IC 50 為（13.1± 1.7）mol · L ^-1，與 ATP 沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合（見(jiàn)圖 5B）。

3 結(jié)論和展望

筆者實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)了預(yù)測(cè)別構(gòu)位點(diǎn)的方法，預(yù)測(cè)了 GPx4、15-LOX、PHGDH 和 PLK1 中的別構(gòu)位點(diǎn)，并分別針對(duì)這些位點(diǎn)成功發(fā)現(xiàn)了別構(gòu)調(diào)控分子。

在過(guò)去的幾十年里，基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)大大加速了藥物發(fā)現(xiàn)的進(jìn)程。別構(gòu)藥物相對(duì)于正構(gòu)藥物所具有的高選擇性和抗耐藥性受到很多關(guān)注。越來(lái)越多的別構(gòu)藥物正被發(fā)現(xiàn)，別構(gòu)藥物涉及的靶標(biāo)也從最初的 G 蛋白偶聯(lián)受體和激酶擴(kuò)展到現(xiàn)在的 14種蛋白類(lèi)別，也有不少別構(gòu)調(diào)控分子被發(fā)現(xiàn)。盡管有這些成功的例子，但是基于結(jié)構(gòu)的別構(gòu)藥物設(shè)計(jì)依然具有很大的挑戰(zhàn)性。主要在于以下 3 個(gè)方面：

1）別構(gòu)位點(diǎn)的預(yù)測(cè)。其一，目前有很多方法和軟件用于別構(gòu)位點(diǎn)預(yù)測(cè)，但因已知的適合用來(lái)訓(xùn)練和測(cè)試的別構(gòu)蛋白的樣本數(shù)量及計(jì)算量有限，這些預(yù)測(cè)方法本身的精度及適用性存在差異，還需要其他更多的研究來(lái)證明其有效性。其二，選擇什么樣的構(gòu)象開(kāi)始進(jìn)行預(yù)測(cè)是研究人員在進(jìn)行別構(gòu)藥物設(shè)計(jì)時(shí)遇到的首要問(wèn)題。最近，張健研究組發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蛋白質(zhì)中正構(gòu)和變構(gòu)位點(diǎn)之間的距離小于 5 ? 時(shí)，選擇結(jié)合底物的蛋白構(gòu)象作為基于結(jié)構(gòu)的變構(gòu)藥物篩選的初始輸入，有助于發(fā)現(xiàn)變構(gòu)藥物。本文介紹的例子中，2 個(gè)例子（PHGDH 和 PLK1）使用結(jié)合底物的蛋白構(gòu)象作為初始輸入，而預(yù)測(cè)得到的別構(gòu)位點(diǎn)都在活性位點(diǎn)附近，支持了此結(jié)論。其三，在別構(gòu)藥物設(shè)計(jì)中，有些別構(gòu)口袋在 apo（不結(jié)合別構(gòu)藥物的構(gòu)象）狀態(tài)時(shí)不存在（hidden allosteric site），這種情況下可能需要進(jìn)行大規(guī)模分子動(dòng)力學(xué)模擬，結(jié)合馬爾科夫狀態(tài)模型（Markov state model）以獲得潛在的別構(gòu)位點(diǎn)。

2）別構(gòu)藥物的優(yōu)化（hit-to-lead optimization）。首先，別構(gòu)藥物的活性往往低于正構(gòu)藥物。由于別構(gòu)藥物的活性與其親和力并無(wú)直接關(guān)系，用傳統(tǒng)的方法對(duì)別構(gòu)藥物優(yōu)化時(shí)，雖然可以提升藥物分子的親和力，但并不一定提升活性，因此產(chǎn)生“flat SAR”或者“l(fā)imited SAR”的現(xiàn)象。其次，別構(gòu)調(diào)控分子細(xì)微的差別即可能導(dǎo)致發(fā)揮的功能不同，理解別構(gòu)分子的機(jī)制對(duì)于別構(gòu)藥物優(yōu)化非常重要。例如，筆者實(shí)驗(yàn)室的 Bi 等在大腸埃希菌趨化研究中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)效應(yīng)分子（chemo effectors）類(lèi)似物CHDCA 和 cis-PDA，二者分別是大腸埃希菌 Tar 受體的拮抗劑（antagonist）和引誘劑（attractant），其結(jié)構(gòu)差別只是后者多了一個(gè) N - H 基團(tuán)，通過(guò)與Tar 受體的相互作用比較發(fā)現(xiàn)，引誘劑都是在合適的位置（靠近 Tyr149 和 Gln152）有 1 個(gè)氫鍵供體基團(tuán)作為信號(hào)的觸發(fā)基團(tuán)。因此，別構(gòu)調(diào)控分子發(fā)揮的作用可以分為兩部分：一部分用于與受體結(jié)合；另一部分起到信號(hào)觸發(fā)（trigger）的作用。類(lèi)似的情況也在 15-LOX 激活劑的介紹部分提到過(guò)，即當(dāng)結(jié)合在別構(gòu)位點(diǎn)的分子沒(méi)有帶正電時(shí)成為抑制劑，而當(dāng)帶正電時(shí)就成為激活劑。綜上，別構(gòu)分子的優(yōu)化復(fù)雜且富有挑戰(zhàn)性。

3）相對(duì)于正構(gòu)位點(diǎn)，別構(gòu)位點(diǎn)的成藥性往往更差，別構(gòu)位點(diǎn)計(jì)算虛擬篩選的成功率也遠(yuǎn)低于正構(gòu)位點(diǎn)，從而限制了別構(gòu)藥物的多樣性。

別構(gòu)藥物的發(fā)展面臨著種種挑戰(zhàn)，但是其在一些新的方向越來(lái)越受到關(guān)注。比如，開(kāi)發(fā)別構(gòu)共價(jià)藥物，可以保留別構(gòu)藥物的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也可以增加藥物-靶標(biāo)配體的半衰期從而降低毒性。筆者實(shí)驗(yàn)室所開(kāi)發(fā)的 CovCys 程序可以探測(cè)蛋白質(zhì)中能夠形成共價(jià)的半胱氨酸，該程序也已集成在CavityPlus 中供直接使用。另外，在開(kāi)發(fā)別構(gòu)藥物對(duì)于蛋白-蛋白相互作用界面的調(diào)控，不可成藥靶標(biāo)的調(diào)控，通過(guò)別構(gòu)研究老藥新用以及理解中草藥在治療復(fù)雜疾病時(shí)所發(fā)揮的作用等方面也有進(jìn)展。從系統(tǒng)生物學(xué)及別構(gòu)網(wǎng)絡(luò)（allo-network）的角度進(jìn)行別構(gòu)藥物的設(shè)計(jì)將會(huì)影響未來(lái)的藥物發(fā)現(xiàn)和發(fā)展。

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