Di屬于長鏈二烷基碳菁類染料，因其獨特的結構使其具有極強親脂性，可與脂溶性生物結構結合，在一定濃度下，可以對細胞膜進行完全染色。Di染料被激發后具有很高的淬滅系數和激發態壽命，在細胞與組織定位示蹤中起到了極大作用。

常見 Di 染料

常見的 Di 染料包括 DiO、DiI、DiD、DiR，在被激發后形成不同顏色的熒光 (如圖 1)。

圖 1. DiO、DiI、DiD、DiR 光譜圖

■DiO 染色為例，簡要拋出體外實驗步驟

a）接種適量數目的細胞，37°C 培養過夜。

b）去除培養基，離心收集細胞，加入 PBS 洗滌 2-3 次，每次 5 分鐘。

c）加入對應濃度 DiO 工作液 (5-10 μM)，室溫孵育 30 分鐘。

d）400 g，4℃ 離心 3-4 分鐘，棄去上清。再次加入 PBS 洗滌細胞 2-3 次，以充分去除未進入細胞內的DiO。

f）用無血清培養基或 PBS 重懸細胞后，在熒光顯微鏡或流式細胞儀下檢測。

圖 2. 實驗流程簡圖

好了，接下來上實例！

■ DiO

DiO 為綠色熒光染料，激發/發射波長為 483/501 nM，DiO 常被用于正向或逆向示蹤各類細胞或組織。(但相較其他三種染料，DiO染料熒光強度較弱，對于某些固定的組織切片染色效果略差)。

Xin Li 等人研究了 CPCs (心臟祖細胞)衍生的外泌體(CPCs-Ex) 是否可以利用 mTOR 信號通路來減少病毒性心肌炎的細胞凋亡。研究人員用 DiO 對 CPCs-Ex 進行標記 (Dio 可通過選擇性分割被納入細胞膜)，評估 H9C2 細胞對 CPCs-Ex 的體外攝取，熒光顯微鏡觀察發現H9C2細胞的每個細胞質均包含熒光信號 (圖 2)，并減少 H9C2 細胞的凋亡，確定了 CPCs-Ex 在 CVB3 感染細胞中的抗凋亡作用。

圖 3. H9C2 細胞攝取 DiO標記的外泌體^[1]

■ DiI

DiI 為橙紅色熒光染料，激發/發射波長為 551/569 nM，DiI 被用于正向或逆向示蹤各類細胞或組織，熒光信號強度高于 DiO，在進入細胞膜時，其熒光信號會被大幅度放大。

如圖 4 所示，Dil 染料標記外泌體，然后與目標細胞共培養。使用共聚焦顯微鏡捕捉 HOS 細胞對 Dil 標記外泌體的攝取，其中被標記的外泌體發出特異性橙紅色熒光。

圖 4. HOS 和 MG63 細胞攝取紅色熒光染料 Dil 標記的 hBMSC-Exos^[2]

Dil染料購自 MCE

■ DiD

DiD 為一種紅色熒光染料，激發/發射波長為 646/663 nM，DiD 熒光信號高、不易淬滅、自身熒光干擾低，不僅用于細胞/組織染色，小動物活體成像中是最常用的。

Yuxuan Fu 等人研究出一種藥物傳輸方法來達到抗新冠藥物更好的進入靶器官的目的，研究者使用DiD 標記細胞外小泡 (EV) 病毒蛋白的受體結合域 (EV-RBD) ，并進行小鼠尾靜脈注射，通過熒光成像可以看到，信號主要在心臟、肺、腎臟中聚集，并且值得注意的是，在 96 h 時，標記的 EV-RBD 累積的熒光信號仍保留在肺組織中，這證明了該方法的可行性。

圖 5. DiD 標記 EV-RBD 在小鼠體內分布情況亡^[3]

DiD染料購自 MCE

■DiR

DiR 是一種近紅外染料，激發/發射波長為 754/778 nm，用于正向或逆向示蹤各類細胞或組織，與 DiD 一樣，DiR 自身熒光背景較低，也被用在活體成像中。

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參考文獻

1. Lei Zhong, Yueshan Li, Shengyong Yang, et al. Small molecules in targeted cancer therapy: advances, challenges, and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2021 May 31;6(1):201.

2. Xin Li , et al. Exosomes derived from carDiac progenitor cells attenuate CVB3-induced apoptosis via abrogating the proliferation of CVB3 and modulating the mTOR signaling pathways.Cell Death Dis. 2019 Sep 18;10(10):691.

3. Yao Huang , et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells promote osteosarcoma development by activating oncogenic autophagy. J Bone Oncol

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