人類免疫缺陷病毒（HIV）攻擊免疫系統(tǒng)，削弱人體對許多感染和某些癌癥的防御能力，而這些感染和癌癥對擁有健康免疫系統(tǒng)者而言本可以戰(zhàn)勝。隨著病毒破壞和損害免疫細胞功能，感染者的免疫系統(tǒng)會逐漸出現(xiàn)缺陷。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織，艾滋病毒仍然是一個主要全球公共衛(wèi)生問題。截至2020年底，估計有3770萬艾滋病毒感染者。2020年，有68萬人死于艾滋病毒相關(guān)原因，150萬人感染艾滋病毒。不可忽略的事實是，目前仍然沒有針對艾滋病毒感染的治愈方法。因此，開發(fā)有效的艾滋病毒治療方法迫在眉睫。

體外移植工程化B細胞，可以分泌廣泛中和抗體（bNAbs）。根據(jù)最新的研究進展，這種方法可以用來生產(chǎn)抗HIV抗體，是一種安全、有效和可擴展的方法，可以幫助開發(fā)出艾滋病疫苗。

2022年6月9日，來自特拉維夫大學(xué)的Adi Barze團隊在Nature biotechnology上發(fā)表了題為In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice的研究性論文，稱找到了一種新的、獨特的艾滋病治療方法，即使用兩種腺相關(guān)病毒載體對體內(nèi)B細胞進行了改造，一種編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (saCas9)，另一種編碼3BNC117，一種抗HIV bNAb，將載體靜脈注射到小鼠體內(nèi)后，可產(chǎn)生高滴度的抗HIV廣泛中和抗體(bNAb)。

首先，研究人員對體內(nèi)B細胞進行了改造，使用了兩種腺相關(guān)病毒載體（AAV-DJ vectors），一種編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (saCas9)，另一種編碼3BNC117，一種抗HIV bNAb。在第一組實驗中，saCas9由CMV啟動子表達，單向?qū)NA靶向saCas9至免疫球蛋白重基因座（IgH）。反過來，bNAb在IgH增強子依賴性啟動子的控制下被編碼為雙順反子盒，并在IgH基因座的 J-C內(nèi)含子內(nèi)與所需的saCas9切割位點同源臂兩側(cè)。bNAb盒包括完整的輕鏈和重鏈的可變區(qū)段(VH)。剪接供體序列跟隨VH基因片段，以使其與恒定IgH外顯子融合，整合到基因座中并隨后進行轉(zhuǎn)錄和剪接。這種設(shè)計有助于破壞內(nèi)源性IgH 基因座和作為膜BCR的初始 bNAb 表達，隨后在抗原結(jié)合上激活工程化B細胞，從而導(dǎo)致分化為記憶細胞和漿細胞。

之后，將工程化B細胞載體靜脈注射到小鼠體內(nèi)，即對小鼠進行免疫，檢測體內(nèi)的抗HIV中和抗體的滴度，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)工程化B細胞為高anti-HIV中和抗體滴度。此外，觀察到體內(nèi)工程化B細胞在生發(fā)中心——脾臟，進行克隆擴增。提示工程化B細胞良好的增殖能力。

為了評估體內(nèi)工程方法可能的脫靶效應(yīng)，首先在各種組織中，量化了中和抗體基因的拷貝數(shù)。在第37天，在肝臟中發(fā)現(xiàn)中和抗體基因具有高拷貝數(shù)，并且在第136天水平僅降低了10倍。從第37天到第136天，骨髓中的AAV拷貝數(shù)顯著增加，并且在淋巴結(jié)中也檢測到了不顯著的相似趨勢，表明這些組織中可能積累了3BNC117表達細胞。然后，研究者使用來自治療小鼠和陰性對照小鼠的肝臟和脾臟的gDNA，對四個潛在的脫靶位點、以及在靶位點進行了靶向測序。相對于來自未經(jīng)治療小鼠脾臟的對照DNA突變率較高的趨勢，表明在肝臟而不是脾臟中，CRISPR-Cas9誘導(dǎo)的雙鏈DNA斷裂修復(fù)容易出錯，而且只在IgH上的靶點，而不是在任何其他檢測的脫靶位點。這說明CRISPR–Cas9脫靶切割率極低，而通過從B細胞特異性啟動子表達saCas9減少了其它組織中靶向切割的產(chǎn)生。

為了更好地表征不同的工程細胞群在體內(nèi)分布聚集情況，接下來使用編碼GFP的供體載體以及3BNC117盒。在分析骨髓和脾臟中的GFP和/或3BNC117表達之前，將受體小鼠免疫兩次。結(jié)果與預(yù)期相符，GFP+、3BNC117+細胞在接受供體和saCas9載體的小鼠脾臟和骨髓中富集。與供體和saCas9載體共注射增加了B細胞表達GFP的比率，特別是脾臟中B細胞表達GFP和3BNC117的比率。值得注意的是，在表達GFP的B細胞中，共注射saCas9 載體導(dǎo)致脾臟和骨髓中的3BNC117+、CD138+漿母細胞顯著增加。

為了進一步提高本方法的安全性，研究者在B細胞特異性啟動子CD19的控制下對saCas9進行編碼。即用20 μg HIV gp120免疫C57BL/6小鼠，6天后每只小鼠與一個編碼saCas9的載體共同注射，由CD19啟動子、以及編碼bNAb和sgRNA 的第二個載體調(diào)控。隨后小鼠接受了多達六次額外的免疫接種。在四次免疫接種后，接受治療的小鼠血液中已含有高達2 μg ml-1的3BNC117中和抗體。第四次免疫后45天，使用 ELISPOT可以在骨髓中檢測到相似的3BNC117分泌細胞率。

為了評估對生物分布和安全性的可能影響，在與donor+sgRNA載體和編碼saCas9的第二種載體（該載體在廣泛啟動子或B細胞特異性CD19啟動子的控制下）共同注射后3天，小鼠被實施安樂死，并進行組織分析。在CD19或脾病灶形成病毒 (SFFV) 啟動子的調(diào)控下，編碼saCas9的載體獲得了相似的轉(zhuǎn)導(dǎo)率。然而，CD19啟動子顯著降低了肝臟中saCas9的表達，而不降低外周血單核細胞中的表達。僅當使用CMV或SFFV啟動子而不是CD19啟動子來驅(qū)動saCas9表達時，肝臟或脾臟中的靶向切割率顯著高于背景。因此，在B細胞特異性啟動子下，在兩個AAV之間分離saCas9和sgRNA的編碼，并表達saCas9，可以將不想要的切割減少到檢測限以下，同時在免疫后呈現(xiàn)高3BNC117滴度。

對于難以攻克的HIV治療，這項研究無異于帶了點點曙光。通過對B細胞進行工程改造，可以在體內(nèi)分泌高滴度的廣泛中和抗HIV抗體，CRISPR–Cas9脫靶切割幾率極低，而且減少了不需要組織中的靶向切割。這是一種安全且有效的方法，未來的應(yīng)用前景非常廣泛，不僅適用于傳染病的治療，還適用于非傳染性疾病的治療，如癌癥和自身免疫性疾病。期待未來，B細胞工程化改造能夠用于臨床，造福千千萬萬的艾滋病病人。

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