文 | 科志康 原創|雙胍

基因治療領域正在以指數級的速度發展。一些基因治療產品現已在全球多個地區獲得批準，大量基因治療產品正在開發中。開展生物分布研究被認為是基因治療產品非臨床計劃的重要組成部分?；蛑委煍祿τ谥С衷缙谂R床試驗中的產品管理和安全監測是必要的。

2019年6月，ICH認可了ICH S12基因治療產品的非臨床生物分布考慮主題。2021年6月3日ICH批準了ICH S12的草案版本，預計最終定稿將于2023年6月頒布實施。S12是第一個針對基因治療產品非臨床開發的ICH指南，為非臨床生物分布研究的設計優化提供了參考，促進基因治療產品的非臨床和臨床開發。

1、簡介

1.1. 目標

本指南旨在為基因治療（GT）產品開發中的非臨床生物分布（BD）研究提供統一建議。本文件為非臨床BD評估的總體設計提供建議，以及提供BD數據的解釋和應用考慮，用于支持非臨床開發計劃和臨床試驗設計。本指南中的建議旨在促進GT產品的開發，同時根據3R原則（減少/完善/替換）避免不必要的動物使用。

1.2. 背景

了解GT產品體內給藥后的BD概況是非臨床開發計劃的一個重要內容。BD數據有助于解釋和設計非臨床藥理學和毒理學研究，以支持目標人群的早期臨床試驗。盡管各國監管機構已發布了包含BD研究建議的指南，但本文件為非臨床BD提供了統一的定義，并傳達了評估GT產品BD的總體考慮因素。

1.3. 范圍

本指南范圍內的GT產品包括通過轉移的遺傳物質表達（轉錄或翻譯）來調節其作用的產品，包括純化核酸（例如質粒和RNA）、經基因修飾以表達轉基因的微生物（例如病毒、細菌、真菌，包括編輯宿主基因組的產品）和體外轉基因人類細胞。本指南還涵蓋旨在體內改變宿主細胞基因組而無需特定轉錄或翻譯（即通過非病毒方法傳遞核酸酶和向導RNA）的產品。雖然某些地區目前尚未考慮GT，但本指南中概述的原則也適用于未經轉基因表達的溶瘤病毒。本指南不適用于預防性疫苗，也不包括未使用基于生物技術的制造工藝生產的化學合成寡核苷酸或其類似物。GT產品通過排泄物（糞便）、分泌物（尿液、唾液、鼻咽液等）或通過皮膚（膿皰、潰瘍、傷口）釋放到體外被稱為“脫落”。GT產品非臨床脫落情況的評估不在本指南的范圍內。GT產品的基因組整合和種系整合評估也不在本指南的范圍內。

2、非臨床BD的定義

BD是GT產品在相關動物物種中的給藥部位以及靶組織和非靶組織（包括生物流體，如血液、腦脊液、玻璃體液）中的體內分布、持續和清除。非臨床BD研究需要使用分析方法來檢測收集樣本中的GT產品和被轉移的遺傳物質，并可以包括檢測被轉移的遺傳物質的表達產物的方法。

3、非臨床BD評估的時機

在非臨床研發早期階段獲得的初步BD數據可能有助于后續藥理學和毒理學研究的物種選擇（見第4.3節）。此外，在評估和解釋非臨床藥理學和毒理學發現時，應提供BD數據。非臨床BD數據還可以為設計首次人體臨床試驗提供信息（見第6節），因此，在臨床試驗開始之前完成非臨床BD評估很重要。

4、非臨床BD研究設計

4.1.一般考慮

BD研究可以作為獨立的BD研究或與非臨床藥理學和毒理學研究結合進行（見第5.3節）。因此，在本文件中，“BD研究”一詞表示兩種情況。在給藥代表擬用臨床產品的GT產品后，應在相關動物物種中進行非臨床BD評估（見第4.3節，可能的替代方案見第4.2節）。重要的是，給藥途徑（ROA）應盡可能反映預期的臨床ROA，并且所研究的劑量水平應充分描述BD概況（見第4.5節）。

驗證BD評估的數據質量、完整性和可靠性非常重要。原則上，非臨床BD研究可以不符合良好實驗室規范（GLP）；然而，當BD評估作為符合GLP的毒理學研究的一部分進行時，所有生命參數和樣品采集程序符合GLP很重要。

4.2. 供試品

非臨床BD研究中使用的供試品應代表預期的臨床GT產品，將制造工藝、重要產品特性（例如效價）和最終臨床配方（見第5.7節）納入考慮。某些情況下，由含不同治療性轉基因或表達標記基因的臨床載體的GT產品生成的非臨床BD數據可用于支持BD概況（見第5.8節），例如，有熒光標記蛋白表達盒的相同血清型和啟動子的腺相關病毒載體。

【首個正式上市的mRNA疫苗Comirnaty（BNT162b2）就是用編碼熒光素酶的modRNA在小鼠中評估遺傳物質的生物分布，用[3H]標記的脂質在大鼠中研究LNP的生物分布。】

4.3. 動物種類或模型

BD評估應在允許遺傳物質轉移和表達的相關動物物種或模型中進行。選擇因素可能包括組織趨性、基因轉移效率以及靶組織和非靶組織/細胞中轉基因表達的物種差異。如果使用有復制能力的載體，動物物種或模型必須允許載體復制。

物種、性別、年齡、生理條件（即健康動物或動物疾病模型）對BD的影響也很重要。此外，應考慮動物物種對給藥載體和/或表達產物產生免疫反應的可能性（見第5.4節）。從評估基因轉移效率的初步研究或分析方法中產生的BD數據可以幫助在后續研究中選擇合適的動物物種進行全面BD評估。

4.4. 動物組別大小和性別

應在每個預定的采樣時間點評估每種性別（如適用）的適當數量的動物，以生成支持全面BD評估的足夠數據（見第4.6節）。關于動物數量的一般建議見注1。根據3R的原則，動物總數可以是幾項研究的總和。應為每個時間點評估的動物數量以及使用多個研究的組合數據（如適用）提供理由。當僅評估一種性別時，還應提供理由。

注1：一般而言，建議每種性別/組/時間點至少評估5只嚙齒動物或3只非嚙齒動物；然而，為每種性別納入相等數量可能并不重要。需要為這些決定提供理由。

4.5. 給藥途徑和劑量水平選擇

GT產品的ROA會影響BD特征，包括轉導的細胞類型和免疫反應。因此，在可行的情況下，應使用預期的臨床ROA給藥GT產品（見注2）。

注2：對于使用的每個給藥裝置，重要的是提供數據以驗證給藥GT產品在動物體內的體積和劑量水平。此信息可能會影響對BD結果的解釋。如果計劃在臨床試驗中使用新型給藥裝置，考慮從使用該裝置或其等效物進行的藥理學和/或毒理學研究中采集BD數據。

所給GT產品的選定劑量水平應提供BD概況的充分特征，以幫助解釋藥理學和毒理學評估。最高劑量水平應為毒理學研究中預期的最大劑量水平（通常受動物大小、ROA/解剖目標或GT產品濃度限制）。然而，如果有適當的理由，預期最大臨床劑量水平也可以作為BD評估的最高劑量水平。

4.6. 樣本采集

目標和非目標組織及生物流體的樣本采集程序應設計為將污染可能性降至最低。必須遵循預先規定的流程，包括對從每只動物（溶媒對照組和給藥GT產品組）獲得的樣品進行適當歸檔，以及記錄樣品采集順序。樣本采集時間點應反映給藥GT產品后，目標和非目標組織/生物流體中GT產品水平達到峰值、穩態（即平臺）和下降（如可行）的預期時間。如適用，可包括其他時間點，以更全面地捕獲穩態期長度并估計持續性。如果適用，應考慮包括重復給藥后的時間點，以便評估GT產品水平。

對于有復制能力的載體，樣本采集時間點還應包括由于載體復制和隨后的清除階段而檢測到的第二峰值水平。

采集的樣本應包括以下組織/生物流體：血液、注射部位、性腺、腎上腺、腦、脊髓（頸、胸、腰）、肝、腎、肺、心臟和脾臟，并可根據其他考慮因素進行擴展，如載體類型/趨性、表達產物、ROA、疾病病理生理學以及動物性別和年齡。例如，其他組織/生物流體可包括外周神經、背根神經節、腦脊液、玻璃體液、引流淋巴結、骨髓，和/或眼睛和視神經。關于最終采集樣本應以對GT產品、目標臨床人群和現有非臨床數據的了解為指導。

如果預計不會出現全身暴露（例如，視網膜下給藥）或給藥部位沒有泄漏，則可以提供選擇特定組織/生物流體的理由。

還可以分析收集的樣本是否存在表達產物。第5.2節提供了有關該評估的考慮因素。

5、具體注意事項

5.1. 分析方法學

對BD概況的評估需要量化組織/生物流體中GT產品的遺傳物質（DNA/RNA）的數量，如果合適，還需要量化表達產物。目前，實時定量聚合酶鏈反應（qPCR）被認為是測量組織/生物流體中特定DNA（或者，通過反轉錄步驟，RNA）的“金標準”。核酸序列的量化對于評估GT產品中遺傳物質的相對數量以及確定其累積或衰減的動力學非常重要。應建立并記錄定量方法的靈敏度和再現性限值。作為分析開發的一部分，應進行加標和回收實驗，以證明在不同組織/生物流體中檢測目標序列的能力。其他技術可用于非臨床研究以監測載體和/或表達產物的BD，包括但不限于：酶聯免疫吸附試驗（ELISA）；免疫組織化學（IHC）；蛋白印跡；原位雜交（ISH）；數字PCR；流式細胞術（FCM）；各種體內外成像技術；以及其他不斷發展的技術。重要的是提供方法的全面描述和所用技術的理由，包括方法的性能參數。

【qPCR檢測特定DNA的靈敏度最高，但目前缺少基于qPCR方法的生物分析相關指導原則】

5.2. 測量表達產物

雖然GT產品遺傳物質的量化是主要的BD評估（見第5.1節），但確定不同組織/生物流體中表達產物的水平有助于描述給藥GT產品后的安全性和活性特征。有關進行此類評估的決定應基于GT產品所需的非臨床BD分析的程度，用基于風險的方法確定。該方法可包括考慮GT產品水平和組織/生物流體中的持續性；目標臨床人群；以及與載體和/或表達產物相關的潛在安全問題。

5.3. 作為藥理學和毒理學研究組成部分的非臨床BD評估

除了獨立研究外，BD評估也可以作為非臨床藥理學和毒理學研究的一部分進行。在這種情況下，BD評估應遵循第4節中規定的建議。如果在單個研究中無法滿足某些建議（例如，每組動物數量或從每只動物收集預先確定的組織/生物流體），則應從多個研究中獲得BD數據（見第4.4節）。

5.4. 免疫原性

動物，尤其是非人靈長類動物和其他非嚙齒類動物對GT載體預存的免疫力可能會影響BD。在進行非臨床研究之前，應考慮對可能存在的載體免疫進行篩查。理想情況下，首選經適當測試確定預存免疫力呈陰性的動物，但可能并不總是可行的。在這種情況下，重要的是將這一考量納入用于將動物隨機分組的無偏方法中。

某些情況下，由于表達產物的物種特異性，動物可能對表達產物產生細胞介導或體液免疫反應。給藥GT產品后，也可能發生對載體的細胞介導免疫反應。這可能導致BD結果無法提供有用信息。如果預計會出現這種情況，申請人可以考慮收集和歸檔適當的樣本，進行可能的免疫原性分析，以支持BD數據的解釋。

不建議僅為了評估BD而對動物進行免疫抑制。然而，如果產品或物種特定的情況需要免疫抑制，則應提供理由。某些情況下，也可以考慮使用物種特異性替代轉基因來規避免疫反應的影響。

5.5. 體外轉基因細胞

體外轉基因細胞（即體外轉導/轉染細胞，然后給動物/人類受試者使用）組成的GT產品的BD評估的注意事項包括細胞類型、ROA以及表達產物或基因修飾影響細胞在體內預期分布的可能性等因素（例如，細胞粘附分子的新表達或改變表達）。此外，動物發生移植物抗宿主病可能會使基因修飾人類T細胞的BD評估解釋復雜化。一般來說，基于全身給藥后預期的廣泛分布，對造血來源的體外基因修飾細胞的BD評估不重要。如果預期分布到靶器官/組織，則應考慮BD評估。

【目前上市的6個CAR-T產品申報BLA所用的藥代動力學試驗】

5.6. 性腺組織中的BD評估

除非目標臨床人群僅限于單一性別（例如，用于治療前列腺癌），否則必須對兩性性腺中的給藥產品進行BD評估。如果載體或轉移的遺傳物質信號通過適當的分析方法不顯示持續性（見第4.6節和第5.1節），則可能無需進一步評估。性腺中GT產品的持續存在可能導致進一步的研究，以確定動物生殖細胞（如卵母細胞、精子）中GT產品水平。這些數據以及其他因素（載體類型、復制能力、整合潛力、劑量水平、ROA等）可以告知意外生殖系整合的風險。有關此問題的更全面討論，請參閱ICH Considerations: General Principles to Address the Risk of Inadvertent Germline Inte- gration of Gene Therapy Vectors, Oct 2006。在非生殖系細胞（例如白細胞、支持細胞、睪丸間質細胞）中檢測GT產品可以確保對受影響的非生殖系細胞的功能的額外考慮，尤其是當細胞類型對成功繁殖很重要時。

5.7. 其他非臨床BD研究的觸發因素

雖然GT產品的非臨床BD評估是在首次人體臨床試驗之前確定的，但以下各種情況可能會導致進行額外的BD評估研究。

? 臨床開發計劃的重大變化，例如：ROA的變化；增加GT產品劑量水平，顯著超過所測試的最大非臨床劑量水平；給藥方案的變化；納入另一個包括兩性的臨床適應癥，而不是最初提出的單一性別。額外的BD評估可納入任何額外的藥理學和/或毒理學研究。

? 載體結構或血清型的顯著變化，以及可能導致趨性變化的任何其他修改。

? 可能影響最終GT產品配方（例如，添加可能改變載體趨性的輔料）或GT產品相關質量屬性（例如，空衣殼比、體外基因轉移活性、產品效價）的制造工藝變化。關于生產變更，需要考慮的其他因素包括載體粒度；聚集狀態；抗原性；以及與其他宿主成分（如血清因子）的潛在相互作用。

5.8. 非臨床BD研究可能不需要或不可行的情況

從使用相同GT產品進行的非臨床研究中獲得的現有BD數據支持不同的臨床適應癥，可能足以滿足新的臨床人群。然而，諸如劑量水平、給藥方案、ROA和啟動子的變化等考慮因素將納入該決定。用先前表征的GT產品獲得的BD數據，該GT產品具有相同的載體結構和決定其組織/細胞取向的其他特征，但轉錄/翻譯產物不同，也可能支持豁免額外的非臨床BD研究。應為這種方法提供理由。

某些情況下，不存在能夠獲知臨床人群中BD概況的相關動物物種。例如，載體與人類細胞上的靶分子結合，但動物細胞上沒有該靶分子時。在這種情況下，重要的是對問題和理由進行全面討論，以支持評估非臨床BD的替代方法。

6、非臨床BD研究的應用

在動物中使用GT產品后的BD概況是非臨床開發計劃的關鍵組成部分。非臨床BD數據有助于全面解釋研究結果，以便更好地理解各種結果（期望的和不期望的）與使用GT產品的關系。將給藥動物中觀察到的結果歸因于遺傳物質（DNA/RNA）和/或表達產物，以確定潛在的益處：GT產品在人體給藥前的風險狀況。根據ROA、劑量水平、給藥方案和動物免疫反應等因素，考慮BD數據與臨床人群的相關性非常重要。這些數據還可以作為首次人體試驗和后續臨床試驗的信息，例如給藥程序（即受試者之間的給藥間隔）、監測計劃和長期隨訪評估。

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